游離二氧化硅粉塵誘轉(zhuǎn)的肺肌成纖維細(xì)胞IGF-Ⅱ受體的表達(dá)及意義.pdf

1、矽肺是在生產(chǎn)過程中長(zhǎng)期吸入大量含游離二氧化硅生產(chǎn)性粉塵所引起的以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為主的全身性疾病。肺纖維化前期主要表現(xiàn)為肺泡巨噬細(xì)胞,中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞增多,后期則表現(xiàn)為大量的間質(zhì)細(xì)胞增生及基質(zhì)成分增多、基質(zhì)膠原進(jìn)行性積聚。在增生的細(xì)胞中,除肺泡上皮細(xì)胞外主要為成纖維細(xì)胞。目前認(rèn)為,矽肺形成過程中巨噬細(xì)胞是游離SiO2粉塵的直接效應(yīng)細(xì)胞。巨噬細(xì)胞受刺激后可釋放多種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、腫瘤壞死因子、纖維

2、粘連蛋白等,刺激成纖維細(xì)胞增生、網(wǎng)織纖維及膠原纖維的合成。雖然肺組織已有的纖維化病變難以消除,但肺纖維化是一個(gè)慢性、進(jìn)行性的病理反應(yīng)過程,探索肺纖維化發(fā)病的分子機(jī)制以延緩或阻斷纖維化發(fā)展仍具有重要的實(shí)際意義。 在纖維化的發(fā)展過程中,肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞起關(guān)鍵作用。肌成纖維細(xì)胞是種在超微結(jié)構(gòu)和功能上兼有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞兩者特征的非典型的成纖維細(xì)胞,其特征性表達(dá)為僅α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。大量研究證明,肺纖維化形成過程中,

3、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β發(fā)揮重要作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ受體在哺乳動(dòng)物多個(gè)組織均有表達(dá),IGF-ⅡR可以結(jié)合前轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β并刺激前轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β裂解和活化形成轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β。也有研究提示IGF-Ⅱ可能通過直接作用于自身或鄰近癌細(xì)胞的IGF-ⅡR,放大細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)信號(hào),加速癌細(xì)胞的自主性生長(zhǎng)。
　　本研究擬通過體外分離培養(yǎng)SD大鼠腹腔巨噬細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞,觀察肺成纖維細(xì)胞暴露于不同濃度的游離SiO2粉塵刺激巨噬細(xì)胞后的培養(yǎng)上清,鑒定肺成纖

4、維細(xì)胞是否可被誘轉(zhuǎn)為肌成纖維細(xì)胞;而后從mRNA、蛋白水平水平上分析誘導(dǎo)后的肺成纖維細(xì)胞IGF-ⅡR表達(dá),探討IGF-ⅡR在誘導(dǎo)后的肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平及意義,為進(jìn)一步研究矽肺的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及治療措施提供參考依據(jù)。
　　方法：1.建立大鼠腹腔巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞體外原代培養(yǎng)模型。成熟SD大鼠腹腔灌洗獲取巨噬細(xì)胞;用胰蛋白酶消化肺組織,分離和純化肺成纖維細(xì)胞,在37℃、5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。利用MTT法描述肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)

5、曲線。
　　2.肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化鑒定。以無血清DMEM培養(yǎng)基為溶劑配制游離SiO2粉塵工作液,終濃度分別為0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml,對(duì)離體原代培養(yǎng)的大鼠巨噬細(xì)胞染毒24h,離心收集Mφ培養(yǎng)上清,并作用于肺成纖維細(xì)胞24h,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞α-SMA蛋白的表達(dá)。
　　3.游離SiO2粉塵刺激巨噬細(xì)胞的上清對(duì)IGF-ⅡR基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響。游離SiO2粉塵工作液對(duì)

6、離體原代培養(yǎng)的大鼠巨噬細(xì)胞染毒24h,離心收集Mφ培養(yǎng)上清,并作用于肺成纖維細(xì)胞24h:(1)提取成纖維細(xì)胞內(nèi)總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),以GAPDH為內(nèi)參照,檢測(cè)成纖維細(xì)胞內(nèi)IGF-ⅡRmRNA水平。(2)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞IGF-ⅡR蛋白的表達(dá)。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(analysis ofvariance,ANOVA)、Bonfferoni兩兩比較、Levene方差齊

7、性檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05)。
　　結(jié)果：:1.本研究分離培養(yǎng)的SD大鼠腹腔巨噬細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞體外生長(zhǎng)良好,可以用于體外實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化鑒定:以0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml游離SiO2粉塵刺激Mφ的培養(yǎng)上清作用于肺成纖維細(xì)胞后24h后,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),高濃度刺激組α-SMA表達(dá)明顯高于對(duì)照組,且隨游離SiO2粉塵濃度增高,

8、肺成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA的量也逐漸增多。
　　3.肌成纖維細(xì)胞IGF-ⅡR mRNA表達(dá)結(jié)果:不同濃度游離SiO2粉塵刺激Mφ的培養(yǎng)上清作用于肺成纖維細(xì)胞24h后,實(shí)驗(yàn)組肺成纖維細(xì)胞IGF-ⅡR mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組,低劑量組(0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);75μg/ml、100μg/ml游離SiO2粉塵組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.肌