第一部分 應用生物發(fā)光顯像技術研究血管生成抑制因子vasostatin的抗腫瘤生成作用;第二部分 hSelK的功能及硒代半胱氨酸的參入機制研究.pdf

1、很多研究表明實體瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉移都與血管生成密切相關。利用血管生成抑制劑進行的腫瘤抗血管生成治療為實體瘤的治療提供了新的策略。一些血管生成抑制劑如endostatin、angiostatin、TNP-470等已被發(fā)現(xiàn)并被應用于研究腫瘤的治療。Vasostatin是1998年Pike等從Epstein-Barrvirus免疫細胞株的培養(yǎng)上清液中分離純化的一種血管生成抑制因子，經(jīng)鑒定證實為多功能蛋白質(zhì)calreticulin的N端結構

2、域片段。Vasostatin在體外可抑制內(nèi)皮細胞如人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的增殖；在裸鼠腫瘤形成試驗中，vasostatin可明顯減低人Burkitt淋巴瘤、人結腸癌和胰腺癌的生長，延長帶MethA和LL/2c腫瘤小鼠的存活時間。 近些年來，基因治療特別是腫瘤基因治療發(fā)展很快。在對轉染基因的定位和表達進行監(jiān)測時，基因顯像是最有效的方法。一些非侵入性的活體成像技術，如PET、SPECT、MRI、超聲、CT、生物發(fā)光顯像和熒光

3、顯像可用于活體動物進行基因表達顯像。其中，生物發(fā)光顯像(Bioluminescenceimaging，BLI)是利用螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase，F(xiàn)Luc)，在ATP、氧氣的輔助下，與外源注入的特異底物反應產(chǎn)生熒光，使用高度靈敏的CCD相機可觀測并紀錄發(fā)出的光子，進行顯像。 將報告基因與所感興趣的治療基因偶聯(lián)，通過對報告基因顯像可以間接監(jiān)測治療基因的表達。本研究采用融合表達方案，將治療基因(vasostat

4、in)和報告基因(fluc)偶聯(lián)構建融合表達載體，通過生物發(fā)光顯像技術對報告基因fluc顯像來監(jiān)測治療基因vasostatin的抗腫瘤生成作用。為使表達的融合蛋白中兩個蛋白互相不干擾，并有天然的特性，我們在治療基因vasostatin和報告基因fluc之間加入了四種不同長度的柔性短肽，其氨基酸序列為(GGGGS)n。然后在293ET和PC3細胞中驗證了四種融合重組質(zhì)粒的熒光素酶活性。其中，含柔性肽段(GGGGS)2的融合表達重組質(zhì)粒(v

5、10fl)熒光素酶活性最佳。 篩選穩(wěn)定表達V10FL融合蛋白和陽性對照Fluc的PC3細胞后，用生物發(fā)光顯像技術進行了體外顯像。結果顯示，陽性對照FLuc能檢測到的最少細胞數(shù)為300～700/孔，而V10FL融合蛋白為1500～3000/孔。兩種穩(wěn)定細胞系中，每孔發(fā)出的光子數(shù)與細胞數(shù)的相關性均很好(r2分別為0.98和0.97)。用穩(wěn)定表達Fluc的PC3細胞構建荷瘤模型，用生物發(fā)光顯像能檢測到腫瘤的發(fā)生，隨著瘤體的增大，生物發(fā)

6、光信號也逐漸增強。 隨后，用前列腺癌細胞系PC3和血管內(nèi)皮細胞系HUVEC研究了vasostatin的體外活性。用腺病毒載體攜帶治療基因vasostatin，感染PC3細胞后，通過RT-PCR能夠檢測vasostatinmRNA表達的增加，Westernblot分析也能在培養(yǎng)上清液中檢測到vasostatin蛋白的分泌。用Ad-vasostatin感染HUVEC和PC3細胞，Ad-vasostatin能夠明顯抑制HUVEC的增殖

7、，而對PC3沒有明顯影響。 硒是哺乳動物必需的一種微量營養(yǎng)元素，其生物學功能主要以硒蛋白的形式表現(xiàn)。硒蛋白的特征是蛋白中含有硒代半胱氨酸(Sec)，硒代半胱氨酸為第21種氨基酸，由通常情況下作為終止密碼子的UGA編碼。真核生物硒蛋白的生物合成過程中，硒代半胱氨酸的參入需要3’非編碼區(qū)(3'UTR)的硒代半胱氨酸插入元件(SECIS)，SECIS結合蛋白SBP2等。目前為止，共鑒定出約25種人硒蛋白基因。人硒蛋白K(hSelK)是

8、新發(fā)現(xiàn)的一種編碼硒蛋白的基因，目前它的生物學功能和硒代半胱氨酸的參入機制尚不清楚。用同位素參入實驗證實了hSelK硒代半胱氨酸的參入需要hSelKmRNA的3'UTR。然后，利用RNA凝膠電泳遷移實驗和SECIS元件突變實驗證實了SBP2能和hSelK3'UTR的SECIS元件相互作用，SBP2能特異性結合hSelKSECIS元件的非Watson-CrickG-A/A-G四聯(lián)體堿基對。為了探尋hSelK的功能信息，用Northern雜交