新芋螺毒素SO-3鎮(zhèn)痛作用的離子通道機(jī)制研究.pdf

1、芋螺毒素(conotoxins，CTX)是來源于海洋芋螺(Conus)毒液的一類活性多肽，大多數(shù)CTX富含二硫鍵，具有特定的分子構(gòu)型，能選擇性地作用于細(xì)胞膜上特異的離子通道或受體等，因而具有多種生物學(xué)效應(yīng)。據(jù)估計約有5萬多種活性多肽存在于芋螺毒液中，迄今僅百余種CTX的作用被闡明，因此CTX具有很大的開發(fā)應(yīng)用潛力。多數(shù)CTX具有很強(qiáng)的神經(jīng)活性，目前一些CTX已被用于某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。例如，ω-CTXMVIIA(MVIIA)是一種N

2、型鈣通道阻斷劑，具有強(qiáng)效鎮(zhèn)痛作用，已被美國FDA批準(zhǔn)上市，用于治療各種慢性難治性疼痛。SO-3是本院從南海線紋芋螺(Conusstriatus)中發(fā)現(xiàn)的一種新的CTX，前期藥理學(xué)研究表明，SO-3也具有強(qiáng)效鎮(zhèn)痛作用，且副作用低于MVIIA，但SO-3發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制尚不清楚。 本研究采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方式，從電壓依賴性離子通道的角度，對具有鎮(zhèn)痛活性的新芋螺毒素SO-3的離子通道靶標(biāo)進(jìn)行了研究，以闡明其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。 一

3、、SO-3對大鼠海馬神經(jīng)元電壓依賴性鈉、鉀、鈣通道的影響 本研究首先采用原代培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元對SO-3作用的離子通道靶標(biāo)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，即使?jié)舛仍黾拥?00μM，SO-3對電壓依賴性鈉電流、延遲整流鉀電流及瞬時外向鉀電流均無明顯影響。然而，SO-3濃度依賴性地抑制高電壓激活的鈣電流，當(dāng)濃度增加到1～3μM，SO-3對HVAICa的抑制達(dá)到一個平臺期。SO-3的上述作用與MVIIA相似，它們抑制HVAICa的EC50

4、分別為0.16μM和0.20μM。電流-電壓關(guān)系的結(jié)果也表明，SO-3對HVAICa具有明確抑制作用，但對低電壓激活的T型鈣電流無明顯影響。 由于海馬神經(jīng)元上存在L、N、P/Q、R四種HVAICa亞型，本研究進(jìn)一步采用交叉給藥的實(shí)驗設(shè)計，觀察了SO-3抑制HVAICa的亞型選擇性。海馬神經(jīng)元的N、L、P/Q型HVAICa能分別被3μMN型阻斷劑MVIIA、10μML型阻斷劑尼莫地平、0.5μMP/Q型阻斷劑ω-蜘蛛毒素IVA(ω

5、-agatoxinIVA，Aga)選擇性阻斷，它們分別約占海馬神經(jīng)元HVAICa的32％、38％和21％。3μMSO-3對HVAICa的抑制作用與3μMMVIIA相似，抑制率約為31％，且3μMSO-3對HVAICa的抑制作用與MVIIA的作用交迭，與10μMNim、0.5μMAga的作用不交迭，提示SO-3可能與MVIIA作用于相同的鈣通道亞型，而與Nim、Aga作用于不同的鈣通道亞型。另外，海馬神經(jīng)元上R型鈣電流的比率約為12％，3

6、μMSO-3對R型鈣電流也沒有明顯的影響。 研究還表明，3μMSO-3與3μMMVIIA對HVAICa的抑制作用都是可逆的，隨著洗脫時間延長，兩者對HVAICa的抑制幾乎完全可逆，但洗脫以后，SO-3對HVAICa的抑制作用的恢復(fù)較MVIIA慢，兩者的半數(shù)恢復(fù)時間分別為7.52±0.56min和4.14±0.45min。 二、SO-3對大鼠背根節(jié)神經(jīng)元電壓依賴性鈣通道的影響 背根節(jié)(dorsalrootgangl

7、ia,DRG)神經(jīng)元為痛覺傳入的第一級神經(jīng)元，在痛覺的產(chǎn)生、傳遞與調(diào)控過程中具有十分重要的作用，本研究進(jìn)一步觀察了SO-3對急性分散的成年大鼠DRG神經(jīng)元電壓依賴性鈣通道的影響。由于DRG中存在多種類型的神經(jīng)元，本研究通過記錄辣椒素電流對DRG神經(jīng)元進(jìn)行了分類。辣椒素陽性反應(yīng)神經(jīng)元的平均ICap為925±57pA，此類神經(jīng)元為傷害感受性神經(jīng)元；辣椒素非陽性反應(yīng)神經(jīng)元在辣椒素刺激下無明顯的ICap產(chǎn)生，此類神經(jīng)元為非傷害感受性神經(jīng)元。Ca

8、p(+)神經(jīng)元的平均電容比Cap(-)神經(jīng)元小，但在電容大小的分布上兩類神經(jīng)元存在明顯的交迭現(xiàn)象，提示根據(jù)電容大小，即細(xì)胞體積不能將這兩類神經(jīng)元進(jìn)行完全區(qū)分。 上述兩類神經(jīng)元具有不同的全細(xì)胞鈣電流特點(diǎn)。I-V關(guān)系的結(jié)果顯示，Cap(-)神經(jīng)元具有明顯的低電壓激活的T型鈣電流。 進(jìn)一步研究表明，SO-3能濃度依賴性地抑制Cap(+)和Cap(-)神經(jīng)元的HVAICa，其抑制作用與MVIIA相似，且在1～10μM濃度范圍內(nèi)，

9、SO-3與MVIIA對HVAICa的抑制達(dá)到一個平臺期。在Cap(+)神經(jīng)元上，1μMSO-3與MVIIA對HVAICa的抑制率分別為63.8％和65.4％，兩者的EC50分別為0.14μM和0.23μM。在Cap(-)神經(jīng)元上，1μMSO-3與MVIIA對HVAICa的抑制率分別為42.3％和43.2％，兩者的EC50分別為0.17μM和0.27μM。 本部分研究又采用與海馬神經(jīng)元部分相同的實(shí)驗設(shè)計，觀察了SO-3抑制DRG神

10、經(jīng)元HVAICa的亞型選擇性。結(jié)果表明，在Cap(+)神經(jīng)元上，1μMSO-3對HVAICa的抑制作用與1μMMVIIA的作用交迭，兩者的敏感電流成分分別約為61％、64％；1μMSO-3與10μMNim、0.5μMAga的作用不交迭，并且1μMSO-3對R型鈣電流也沒有明顯影響。在Cap(-)神經(jīng)元上，1μMSO-3與1μMMVIIA對HVAICa的抑制作用也存在明顯的交迭現(xiàn)象，兩者的敏感電流分別約為42％、45％。以上結(jié)果提示，在1

11、μM濃度時，SO-3可能選擇性地抑制Cap(+)與Cap(-)神經(jīng)元的N型鈣電流，而對L、P/Q及R型鈣電流無明顯影響。 三、SO-3對原代培養(yǎng)的大鼠脊髓背角神經(jīng)元電壓依賴性鈣通道的影響 脊髓背角(dordalhorn,DH)是傷害性信息傳入的門戶和整合的初級中樞，參與痛覺的傳遞與調(diào)制，本研究進(jìn)而對原代培養(yǎng)的新生大鼠DH神經(jīng)元的全細(xì)胞鈣電流在不同體外培養(yǎng)時間的特點(diǎn)進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，DH神經(jīng)元的鈣電流幅度及密度均隨培養(yǎng)

12、時間的延長而逐漸增大。與3DIV(dayinvitro)時相比，7DIV時鈣電流密度有較大幅度的增加，到14DIV時，鈣電流密度增幅減緩。進(jìn)一步對HVAICa亞型的研究表明，隨培養(yǎng)時間延長，DH神經(jīng)元呈現(xiàn)一個趨勢，即L型比率逐漸減少，N、P/Q型比率逐漸增多。在3DIV時，L、N型比率較高，分別為39.1％、36.7％；在7DIV、14DIV時，N型比率最高，分別為47.7％、49.9％。 在上述研究基礎(chǔ)上觀察了SO-3對7DI

13、VDH神經(jīng)元鈣電流的影響。結(jié)果表明，0.01、0.1、1μMSO-3對7DIVDH神經(jīng)元的HVAICa均具有抑制作用；隨著濃度增加，SO-3的抑制作用增加。SO-3對DH神經(jīng)元HVAICa的抑制與MVIIA相似；在1μM時，兩者的抑制率分別為50.9％與53.3％。I-V關(guān)系的研究也表明，SO-3與MVIIA對DH神經(jīng)元鈣電流的I-V曲線的影響相似。 四、SO-3對HEK293細(xì)胞瞬時表達(dá)的鈣通道的影響 為進(jìn)一步觀察SO

14、-3對單獨(dú)表達(dá)的各種鈣通道亞型的影響，本研究又采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將各種來源于人類或大鼠神經(jīng)元的鈣通道α1亞基(α1C(L)、α1B-1(N)、α1A-2(P/Q)或α1E-3(R))分別與α2bδ、p1b亞基同時混合轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，成功地瞬時表達(dá)了L、N、P/Q、R四種鈣通道亞型。 研究表明，0.01、0.1、1μMSO-3對表達(dá)的N型鈣通道的HVAIBa均具有抑制作用；隨著濃度增加，抑制作用增大，在1μM時，N型HVA

15、IBa幾乎全部被SO-3抑制。在0.1μM時，SO-3對N型HVAIBa的抑制率大于MVIIA；兩者的抑制率分別為68.6％、52.0％。I-V關(guān)系的研究也表明0.1μMSO-3對N型IBa的抑制作用高于0.1μMMVIIA。進(jìn)一步對通道的動力學(xué)狀態(tài)的研究表明，SO-3能作用于N型鈣通道的靜息態(tài)、失活態(tài)、開放態(tài)三種通道狀態(tài)。 對表達(dá)的非N型鈣通道的研究表明，1μMSO-3對L、P/Q、R型HVAIBa均無明顯影響。在30μM的高

16、濃度時，SO-3對L、P/Q、R型HVAIBa均具有抑制作用，但該濃度時SO-3對上述非N型HVAIBa的抑制均明顯低于相同濃度MVIIA。30μMSO-3對L、P/Q、R型HVAIBa的抑制率分別為13.3％、12.8％、17.7％；30μMMVIIA的抑制率分別為25.9％、29.1％、34.4％。 1μMSO-3與MVIIA對表達(dá)的N型鈣通道的HVAIBa的抑制也都是可逆的。洗脫15min以后，被SO-3抑制的N型電流約7

17、3％被恢復(fù)，被MVIIA抑制的N型電流約86％被恢復(fù)。另外，30μMSO-3與MVIIA對表達(dá)的L、P/Q、R型HVAIBa的抑制作用約在3～4min內(nèi)幾乎完全恢復(fù)。 通過上述研究，獲得如下主要結(jié)論： 1.SO-3選擇性地作用于電壓依賴性鈣通道，而對電壓依賴性鈉通道、鉀通道沒有選擇性的作用。由于O超家族中選擇性作用于電壓依賴性鈣通道的芋螺毒素從功能上被定義為ω-芋螺毒素，因此，SO-3是一種新的ω-芋螺毒素。 2