具有鎮(zhèn)痛活性的信號芋螺毒素結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究.pdf

1、芋螺毒液是海洋軟體動物芋螺進行防御、捕食和競爭的有力武器。它的成分復(fù)雜，主要是一類分子量小、生理活性高的混合多肽，稱之為芋螺毒素。芋螺毒素作用于多種神經(jīng)靶位點，并具有高度選擇性，可開發(fā)為治療神經(jīng)類疾病的多肽藥物，同時作為神經(jīng)生物學的工具探針廣泛使用。
　　 本實驗室從中國南海信號芋螺(Conus litteratus)中分離純化得到一種T-超家族毒素，半胱氨酸骨架為CC-C-C，命名為lt5d，為電壓門控的鈉離子通道抑制劑。同時

2、從cDNA文庫中得到一個L-超家族毒素，半胱氨酸骨架為C-C-C-C，命名為lt14a，是配體門控的乙酰膽堿通道拮抗劑。2種毒素都具有潛在的鎮(zhèn)痛活性。
　　 本論文根據(jù)2種信號芋螺毒素的氨基酸序列，進行了化學固相合成。采用NMR的方法解析了lt14a的空間結(jié)構(gòu)。在200 ms混合時間，300 K溫度下，共得到79個NOE。計算后得到200個模擬產(chǎn)物，取能量最低的20個結(jié)構(gòu)進行分析，主鏈的RMSD值為0.37±0.17 A，含有2

3、個反向平行的β折疊和3個轉(zhuǎn)角，形成4個氫鍵，同時推測lt14a的二硫鍵連接方式為1-3，2-4。
　　 由于lt5d的NMR譜圖上得到的NOE比較少，所以我們利用Insight II和Hyperchem8.0軟件對lt5d的結(jié)構(gòu)進行了計算機結(jié)構(gòu)模擬。lt5d與lt14a的空間結(jié)構(gòu)類似，以β-折疊和轉(zhuǎn)角為主要結(jié)構(gòu)，第6位帶正電的Lys突出結(jié)構(gòu)平面，推測與鈉離子通道直接作用，因此對其生物活性有重要影響。
　　 為進一步探討芋

4、螺毒素結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，我們設(shè)計合成了3個突變體，分別為lt14a的突變體[K7A]-lt14a、lt5d的2個突變體[K6A]-lt5d與lt5d-2P，希望通過多肽改造發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的氨基酸殘基。
　　 分別在組織水平和整體動物水平對2種天然芋螺毒素和3種突變體進行活性檢測。電生理結(jié)果表明，在100μM的濃度下，lt14a及[K7A]-lt14a、lt5d及l(fā)t5d-2P在給藥15分鐘后都對蛙坐骨神經(jīng)動作電位起到不同程度的抑制

5、作用，[K6A]-lt5d在給藥30分鐘內(nèi)沒有抑制作用。整體動物的藥效學實驗表明，lt14a、[K7A]-lt14a。lt5d與lt5d-2P都具有不同程度的鎮(zhèn)痛活性，[K6A]-lt5d則喪失了鎮(zhèn)痛活性。此外，細胞毒性實驗顯示，5種多肽對人張氏肝細胞Chang liver沒有毒性，但輕微影響肝癌細胞HepG2的存活率，使其降低到70-90％。
　　 構(gòu)效關(guān)系的研究結(jié)果表明，反向平行的β-折疊結(jié)構(gòu)和2對二硫鍵，使lt14a保持了

6、穩(wěn)定的空間構(gòu)象。第7位帶正電的Lys突變成非極性的Ala后提高了生物活性，結(jié)構(gòu)中的β-折疊沒有受到突變的影響，但由于斥力降低，突變體的空間構(gòu)象變得緊密，同時疏水表面連接成片，有利于配體受體之間的相互結(jié)合。lt5d中，帶正電的Lys突變后活性大幅下降，幾近喪失，證明Lys是關(guān)鍵氨基酸，與鈉離子通道有直接作用。Pro和Asp對lt5d的結(jié)構(gòu)與活性影響均不大。
　　 本文的研究為改造多肽、提高芋螺毒素的鎮(zhèn)痛活性和降低分子大小提供了理論