信號芋螺毒管基因表達(dá)分析及幾種芋螺多肽的天然純化、重組表達(dá)與活性鑒定.pdf

1、芋螺是廣泛分布在全世界熱帶海域的肉食性軟體動物。芋螺毒液中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的活性多肽是其捕食、防御與競爭的主要武器。由于芋螺毒素可以高度特異地作用于細(xì)胞膜上不同亞型的離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)受體，因而作為藥理學(xué)研究的工具得到廣泛應(yīng)用，其中的一些已經(jīng)或有望被直接開發(fā)成藥物用于疾病的診斷和治療。 本文以中國南海食蟲性信號芋螺為研究對象，首次構(gòu)建和系統(tǒng)分析了信號芋螺毒管組織的cDNA文庫；同時(shí)從該物種分離純化了數(shù)十種天然芋螺多肽。在此基礎(chǔ)上，利用生

2、物信息學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)以及電生理的技術(shù)和手段展開了一系列的研究工作。 通過對文庫克隆的隨機(jī)測序和生物信息學(xué)分析，得到的897條有效ESTs序列被聚成了305個(gè)基因簇。在獲得的序列當(dāng)中，有412條(對應(yīng)于42個(gè)基因簇)為毒素序列，約占總EST序列的45.9％。其中T-超家族芋螺毒素有222條EST序列(14個(gè)基因簇)，在所有毒素成分中占據(jù)了主導(dǎo)地位，約占總芋螺毒素序列的53.9％；此外，O-超家族和M-超家族芋螺毒素序列

3、分布較多。研究表明不同超家族毒素和各芋螺毒素基因的出現(xiàn)頻率存在數(shù)量級的差異。通過序列比較發(fā)現(xiàn)，毒素前體分子從N-端到C-端，變異數(shù)率依次遞減；具有同一信號肽序列的超家族可能衍生出多種不同半胱氨酸骨架的成熟肽序列。除了常見超家族成員之外，文庫中還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的芋螺毒素超家族(L-超家族)和三個(gè)新的半胱氨酸骨架。對于信號芋螺毒素基因表達(dá)情況系統(tǒng)全面的了解，不僅為新毒素基因結(jié)構(gòu)和功能研究的開展奠定了基礎(chǔ)，還將有助于芋螺毒素分子多態(tài)性及其進(jìn)化機(jī)

4、理的研究。 我們采用凝膠過濾、離子交換層析和高效液相色譜的方法從信號芋螺毒管中分離純化新的芋螺多肽。共獲得約100余個(gè)芋螺多肽成分，我們對其中的72條序列進(jìn)行了MOLDI-TOF質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)全部是新的芋螺毒素序列。選取其中的十條序列進(jìn)行Edman降解測序，其中六條與cDNA文庫預(yù)測的序列相一致。本文側(cè)重研究了其中的兩條序列l(wèi)t3a和lt3b的結(jié)構(gòu)及其功能。通過蛋白測序和結(jié)構(gòu)分析表明這兩條序列存在谷氨酸羧化等新的翻譯后修飾。膜片

5、鉗試驗(yàn)結(jié)果表明，它們可以增加大鼠背根神經(jīng)節(jié)鈉離子通道的開放電流。這是首次發(fā)現(xiàn)可以增大鈉離子通道開放電流的芋螺毒素。 在新獲得的毒素cDNA序列中，發(fā)現(xiàn)了兩條全長O-超家族毒素序列——lt6.3與lt7.1(其編碼的蛋白質(zhì)分別命名為lt6c和lt7a)在理化性質(zhì)上與作用于鈉離子通道的mu家族芋螺毒素接近，且序列上也具有較高的同源性。為了探明這兩個(gè)毒素的作用靶位及作用特點(diǎn)，我們利用基因工程手段，采用了pTRX表達(dá)系統(tǒng)將lt6.3

6、與lt7.1成熟肽編碼序列轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行了融合表達(dá)。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了蛋白的表達(dá)和純化條件，最終獲得了高純度的重組毒素蛋白。利用飛行時(shí)間質(zhì)譜對重組蛋白進(jìn)行物理性質(zhì)的鑒定，結(jié)果顯示毒素蛋白的分子量與預(yù)測結(jié)果相一致。同時(shí)，膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這兩種毒素均可以阻斷電壓敏感型鈉通道而不改變通道的激活與失活的動力學(xué)曲線，且這種作用具有濃度梯度依賴性。 通過對信號芋螺毒管cDNA文庫的構(gòu)建以及EST分析，深化了人們對芋螺毒素基因表達(dá)特點(diǎn)的認(rèn)識，從而