芋螺毒素MiEr91與MaI126基因在畢赤酵母中的分泌表達研究.pdf

1、芋螺(Conus)是一類能夠分泌毒液的海洋產(chǎn)軟體動物，全世界約有500多種，遍布各暖海區(qū)。我國約有60～70種，主要分布在海南島、西沙群島和臺灣海域。芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是一類由芋螺分泌出來的，有8～41個氨基酸殘基組成的小分子多肽，富含二硫鍵。大多數(shù)芋螺毒素多肽的分子較小，結(jié)構(gòu)豐富。每種芋螺毒素能夠選擇性作用于一種特定離子通道或受體，如Ca2+通道、Na+通道和K+通道，受體如乙酰膽堿受體、5-羥色氨受體等。由于芋螺

2、毒素能夠區(qū)別作用一些結(jié)構(gòu)非常相近的離子通道或受體亞型，因此，可被直接開發(fā)成為作用離子通道的藥物或先導(dǎo)化合物，有些有潛在的治療和診斷功能。所以芋螺毒素已成為藥理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)的有力工具和藥物開發(fā)的新來源，是全世界海洋藥物研究的熱點之一.已經(jīng)成功研究的芋螺毒素大多屬于A-超家族，O-超家族和M-超家族等，如MVIIA，SO3等。而對T-超家族芋螺毒素的研究，則鮮見報道。 本文嘗試了兩個海南產(chǎn)新芋螺毒素MiEr91和MaI126的基因在

3、畢赤酵母(Pichiapastoris)細胞中進行分泌表達的研究。屬于O-超家族的芋螺毒素MiEr91前體基因來自海南產(chǎn)勇士芋螺(Conusmiles)；屬于T-超家族的芋螺毒素Mal126前體基因來自海南產(chǎn)大理石芋螺(C.marmoreus)。首先從MiEr91的前體蛋白基因cDNA中亞克隆出不帶有信號肽的成熟肽基因，并在其兩端添加適合酵母表達載體構(gòu)建的酶切位點。同樣從MaI126的前體蛋白基因cDNA中亞克隆出帶有信號肽的前體基因，

4、人工合成其成熟肽基因，在它們的兩端也添加了適合酵母表達載體構(gòu)建的酶切位點。上述亞克隆基因插入T-easy載體中，經(jīng)測序驗證后用于酵母表達載體的構(gòu)建。酵母表達載體pPICZA及pPICZαA分別用KpnI/ApalI、EcoRI/XbalI雙酶切后，與相應(yīng)的目的基因片段連接后，成功構(gòu)建了3個重組表達質(zhì)粒pPICZA-77-78、pPICZαA-89-90、pPICZαA-97-98，并已通過PCR及DNA測序證明序列無誤。重組表達質(zhì)粒經(jīng)S