芋螺毒素Ma6A與MaI126的生物法合成研究.pdf

1、芋螺(Conus)屬腹足綱軟體動物,全球約500多種。芋螺毒素(Conotoxin,Conopeptide,CTX)是從芋螺中得到的一類具有生物活性的多肽毒素。最近研究表明,每種芋螺可能含有1000-1900種芋螺毒素,即全世界大約有＞500000種芋螺毒素,大大超過了以前認為有約5萬種芋螺毒素的認識。芋螺毒素通常是由8～40個氨基酸殘基組成,富含二硫鍵,化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎,生物活性強,作用靶位的選擇性高,目前發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素超家族主要有A-,

2、T-,O-,M-,P-,I-和S-超家族等。它們已在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域和新藥研制方面受到了前所未有的廣泛關(guān)注,因此對芋螺毒素進行深入研究很有意義。由于天然芋螺毒素含量甚微,有關(guān)芋螺毒素的研發(fā)大多轉(zhuǎn)向人工化學(xué)合成,但其毒性大、產(chǎn)率小、純度低、成本很高,尤其是對于分子量較大的多肽,合成更為困難,合成的線性肽還要經(jīng)過氧化折疊等繁瑣的步驟才能獲得具有二硫鍵配對正確的生物活性肽。因此,大量芋螺毒素藥物寶庫的開發(fā)僅靠化學(xué)合成還不能滿足作為藥物研究和商

3、業(yè)化生產(chǎn)的要求。已知芋螺毒素在體內(nèi)是由其前體基因經(jīng)表達和翻譯后修飾而獲得的直接產(chǎn)物,因而通過基因體外重組表達,進行生物法合成是大量獲得目的毒素肽的有效新途徑。
　　 本研究探索用生物法合成2個芋螺毒素Ma6A和MaI126,以期低成本大量獲得這2個毒素肽。芋螺毒素Ma6A和MaI126的基因均來自于大理石芋螺(Conus marmoreus),其中Ma6A是O-超家族基因,MaI126是一種新型T超家族芋螺毒素基因。Ma6A成熟

4、肽含有31個氨基酸,三對二硫鍵,具有阻斷鈉離子通道的生物活性;MaI126含有13個氨基酸,兩對二硫鍵。我們選用畢赤酵母真核生物表達系統(tǒng)來重組生產(chǎn)芋螺毒素Ma6A和MaI126,期望通過畢赤酵母細胞內(nèi)的翻譯后修飾系統(tǒng)對外源芋螺毒素Ma6A和MaI126基因進行分泌表達,所得的重組芋螺毒素在酵母細胞分泌表達過程中完成氧化折疊,直接將具有天然芋螺毒素構(gòu)象的重組多肽分泌到培養(yǎng)基中,通過進一步分離純化,即可大量獲得目的芋螺毒素肽。
　　

5、 本研究通過設(shè)計Ma6A成熟肽的基因序列,利用酵母信號肽,與畢赤酵母表達載體pPICZαA相連,構(gòu)建了分別含有純化蛋白標(biāo)簽和不含純化蛋白標(biāo)簽的表達載體pPICZαA-Ma6Af與pPICZαA-Ma6An。實驗室已構(gòu)建好的、含有MaI126基因的酵母表達載體pPICZA-MaI126,利用了芋螺毒素MaI126基因本身的信號肽。將上述構(gòu)建好的各種表達載體進行線性化,并優(yōu)化電轉(zhuǎn)化條件,將3種表達載體分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母宿主菌中,經(jīng)Zeocin

6、抗生素篩選和PCR產(chǎn)物回收連接T-載體后,進行測序鑒定,選取含有完整目的基因、且拷貝數(shù)高的重組子,利用甲醇進行了誘導(dǎo)表達。
　　 在誘導(dǎo)過程中,探索和優(yōu)化了誘導(dǎo)表達條件、以及載體與宿主菌之間的相互匹配。結(jié)果表明,最佳誘導(dǎo)時間為72h,最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇MM;通過比較3種不同酵母宿主菌(GS115、KM71、X-33)的誘導(dǎo)表達效果可知,芋螺毒素在宿主菌X-33中誘導(dǎo)表達效果較好,表達產(chǎn)物經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳分析