中國南海新型芋螺毒素的化學(xué)合成、活性測(cè)定及表達(dá)條件初探.pdf

1、芋螺毒素（CTx）是由芋螺毒腺管分泌的一類具有生物活性的小肽，富含二硫鍵，能特異性地作用于多種離子通道（Na+、K+、Ca2+等）和膜受體，具有很高的神經(jīng)藥理學(xué)研究價(jià)值。有顯著鎮(zhèn)痛活性的芋螺毒素，如MVIIA，已用于臨床。目前保守估計(jì)全世界有5萬種芋螺毒素，但僅有少數(shù)毒素的功能得到鑒定，我國豐富的芋螺毒素資源亟待開發(fā)。
　　本課題旨在通過化學(xué)合成和基因工程兩種途徑獲得新的芋螺多肽，測(cè)定其二硫鍵連接方式，并對(duì)部分多肽的鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行初

2、步評(píng)價(jià)，為后續(xù)多肽的功能鑒定及構(gòu)效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。具體工作如下：
　?。?）采用Fmoc-固相肽合成法合成了25條芋螺多肽線性肽：conantokins（4條），α-芋螺毒素（15條）和M超家族多肽（6條）。然后利用空氣氧化折疊法獲得含二硫鍵的芋螺毒素，除M族部分芋螺毒素因結(jié)構(gòu)原因無法得到正確折疊產(chǎn)物外，其余多肽均有主產(chǎn)物生成，質(zhì)譜鑒定分子量正確。兩步氧化折疊及HPLC共洗脫結(jié)果顯示所測(cè)定的α-芋螺多肽折疊主產(chǎn)物的二硫鍵連接方式

3、為（Cys1-Cys3，Cys2-Cys4），與已報(bào)道的天然α-芋螺多肽的二硫鍵框架一致。
　?。?）利用大鼠坐骨神經(jīng)半切模型（PSL）對(duì)liu-5、liu-6、liu-7、liu-16、liu-21和T4等6種α-芋螺多肽的7個(gè)折疊主產(chǎn)物的鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示除liu-6、liu-7沒有明顯鎮(zhèn)痛活性外，其它折疊產(chǎn)物都表現(xiàn)出較強(qiáng)鎮(zhèn)痛活性，且效果較陽性對(duì)照Vc1.1持久。給藥劑量為3 nmol/只時(shí)，給藥1.5h后liu-5

4、可使大鼠痛閾提高約97％，遠(yuǎn)高于Vc1.1；α4/7-liu-16和α4/8-T4的鎮(zhèn)痛活性略低于Vc1.1。
　?。?）采用融合蛋白表達(dá)體系對(duì)芋螺毒素的表達(dá)條件進(jìn)行探索。將目的基因插入載體pGEX-6p-1，與GST融合表達(dá)。誘導(dǎo)條件經(jīng)優(yōu)化后（IPTG終濃度0.5 mM，23°C誘導(dǎo)8 h），可溶性融合蛋白表達(dá)量可達(dá)12-15 mg/L培養(yǎng)物，親和層析后獲得與理論分子量一致的高純度GST融合蛋白。酶切后生成多個(gè)小分子量片段。定性