炭疽毒素受體的組織分布和活性位點的結構與功能研究.pdf

1、目前已確認炭疽毒素在哺乳動物細胞上有兩種天然受體CMG2與TEM8，但是這兩種受體在體內的天然功能，以及在不同組織的分布還不十分清楚。已有的研究表明，CMG2與炭疽保護性抗原PA的親合力比TEM8大的多，重組表達CMG2胞外區(qū)比重組表達TEM8胞外區(qū)的細胞保護活性高一百多倍，究竟CMG2是起主要作用的受體，還是TEM8是主要受體，或兩者同樣重要，也是未知。弄清兩者的組織分布和分子結構上的差異將為正確理解毒素致病機理與設計新型毒素抑制劑提

2、供依據(jù)。 為了解炭疽毒素受體的組織分布，本研究制備了兩種受體的單克隆抗體，獲得了針對CMG2的單克隆抗體485和4G3，針對TEM8的單克隆抗體2D6和489，以及可同時結合兩者的單克隆抗體2G4，其中485還具有一定的細胞保護活性。經(jīng)鑒定485和2D6可用于ATR體內外分布的檢測，在對小鼠的9個組織器官進行了Western blotting和免疫組化檢測后發(fā)現(xiàn)，CMG2和TEM8廣泛分布于各組織器官，在一些關鍵的組織中有明顯的

3、差別，不能確定兩種受體在機體內的分布誰強誰弱，但是在分布上的差異可能暗示了在不同的炭疽感染途徑中是不同的受體在起作用，肺炭疽時可能CMG2和TEM8均起作用，皮膚炭疽和腸炭疽時則可能是TEM8為主。 出于探索炭疽毒素受體的結構與功能，本研究還用大腸桿菌表達系統(tǒng)克隆表達了六個CMG2胞外區(qū)截短片段，經(jīng)蛋白純化后，進行了Western blotting和細胞保護性實驗分析。結果顯示六個截短的CMG2蛋白均可與485單抗結合，其中CM

4、G2(40-133)、CMG2(40-159)、CMG2(40-186)和CMG2(40-202)失去了細胞保護活性，CMG2(40-212)、CMG2(40-207)保持了很強的細胞保護活性。經(jīng)綜合分析，可以初步確定，485的結合位點在CMG2上40-133氨基酸之間， CMG2的203-207段FQALK氨基酸殘基可能是PA與CMG2相互作用的關鍵序列。 此外，以單抗485為靶分子對噬菌體隨機12肽庫進行了篩選，希望得到一批

5、特異性結合485的噬菌體肽，用來分析CMG2活性位點的組成和結構。結果顯示，隨機挑選的8個陽性克隆能夠特異性結合485，并被CMG2所抑制，表現(xiàn)了它軍事醫(yī)學科學院碩士學位論文們之間的結構相關性。經(jīng)序列對齊比較，8個陽性克隆與CMG2(40-217)可確定一個共有序列：YI---LK，位于CMG2上的119-125處，與MIDAS基序中的關鍵氨基酸T118相臨。此共有序列在TEM8中沒有被發(fā)現(xiàn)，而這種不同也許就是它們在細胞保護性方面差異比