炭疽毒素致死因子的重組制備與檢測(cè)方法研究.pdf

1、炭疽是一類嚴(yán)重威脅人類健康的烈性傳染病,其病原體為炭疽芽孢桿菌(簡(jiǎn)稱炭疽桿菌)。炭疽桿菌在不適宜的生存條件下會(huì)形成具有極強(qiáng)抗逆性的芽孢,其芽孢由于具有存活時(shí)間長(zhǎng)、易于制備、易于散布等特性,是非常理想的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖的原材料。
　　炭疽桿菌的毒力因子有兩大類,一是莢膜,一是外毒素。莢膜的功能是抵抗宿主的吞噬作用,幫助炭疽桿菌在宿主體內(nèi)感染和生存。而炭疽桿菌的外毒素則被認(rèn)為是其致死的最主要因素,包含三種成分,水腫因子(edema

2、factor,EF),致死因子(lethal factor,LF),保護(hù)性抗原(protective antigen,PA)。其中PA可以與其細(xì)胞表面受體結(jié)合,被furin樣蛋白酶切割并組裝成七聚體或八聚體;EF和LF可以與PA多聚體結(jié)合,形成的復(fù)合物通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在胞質(zhì)內(nèi),EF具有腺苷酸環(huán)化酶的活性,能夠上調(diào)cAMP的水平,LF具有金屬蛋白酶的活性,能夠切割MEK蛋白家族的成員。學(xué)界目前對(duì)炭疽感染者損傷甚至死亡的具體機(jī)制還不清

3、楚,但認(rèn)為兩類炭疽毒素,致死毒素LT(lethal toxin,即PA與LF的混合物)和水腫毒素ET(edema toxin,即PA與EF的混合物)在其中發(fā)揮著主要作用,這也是炭疽感染晚期單純的抗生素治療難以發(fā)揮療效的原因。
　　因此,在炭疽感染中,準(zhǔn)確檢測(cè)毒素水平顯得非常必要:在感染早期,對(duì)毒素的檢測(cè)可以作為診斷手段;在治療中,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)毒素水平的變化對(duì)于評(píng)價(jià)治療效果和患者的安全狀況也有重要的意義。
　　LF作為炭疽桿菌外毒

4、素的重要組成部分,是炭疽感染中造成損傷和致死的主要成分之一,因此本研究的主要目標(biāo)之一就是期望建立方便靈敏實(shí)用的針對(duì)LF的檢測(cè)方法。為了給檢測(cè)方法研究準(zhǔn)備材料,同時(shí)也為了給本室及其他同行關(guān)于LF作用機(jī)理的研究提供支持,本研究將建立簡(jiǎn)單高效的LF制備方法作為本研究的另一重要目標(biāo)。
　　目前在LF的制備工作中存在的主要問(wèn)題包括生物安全風(fēng)險(xiǎn),氨基酸序列尤其是N端序列有異于天然蛋白,純化工藝復(fù)雜、效率不高等。
　　本研究立足于大腸桿菌

5、表達(dá)系統(tǒng),從而降低了生物安全的風(fēng)險(xiǎn)。但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn),目的蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平又成為了限制條件。
　　因此,本研究從核酸水平上對(duì)LF表達(dá)的限制因素進(jìn)行了分析。通過(guò)構(gòu)建一系列的截短突變體進(jìn)行表達(dá)分析,并借助網(wǎng)絡(luò)工具JCat進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)LFC端的編碼序列存在兩個(gè)稀有密碼子密集的區(qū)域,推測(cè)這兩段序列限制了LF在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平。通過(guò)對(duì)這兩個(gè)區(qū)域的密碼子進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了LF表達(dá)量的提高。
　　在此基

6、礎(chǔ)上,對(duì)周質(zhì)蛋白的抽提方式和LF的純化方法進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的滲透休克法處理和CHTTM陶瓷羥基磷灰石層析柱與Source 30Q陰離子層析柱兩步層析純化,可以得到純度大于95％的目的蛋白,產(chǎn)量可達(dá)5mg/L。
　　利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫印跡分析、氨基端測(cè)序,以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)和大鼠攻毒試驗(yàn),對(duì)LF進(jìn)行了性質(zhì)鑒定。結(jié)果表明,該方法可以得到純度高(大于95%)、序列天然、活性高的LF,可以滿足炭疽基礎(chǔ)研究、疫苗和防治藥物研

7、究等多種需求。
　　在LF制備工藝建立起來(lái)的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步探索了LF的檢測(cè)方法?？紤]到LF具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,本研究關(guān)注了利用LF的細(xì)胞毒性對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的可行性。小鼠巨噬細(xì)胞系J774A.1細(xì)胞對(duì)LF的細(xì)胞毒性非常敏感,因此利用該細(xì)胞檢測(cè)LF可能會(huì)得到比較理想的靈敏度。本研究首先利用細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)定了LF作用于J774A.1細(xì)胞的EC50值,在此基礎(chǔ)上,對(duì)檢測(cè)過(guò)程中的條件進(jìn)行優(yōu)化,建立起了操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的LF檢測(cè)方法。該

8、方法在Fischer344大鼠模型中得到了驗(yàn)證,并利用該方法,初步計(jì)算了LF在Fischer344大鼠血液內(nèi)的半衰期。該部分工作建立了利用細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)血液中LF的方法,該方法在靈敏性、經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性等方面顯示了一定的優(yōu)勢(shì),為炭疽的相關(guān)研究及臨床診斷和治療中的LF檢測(cè)提供了新的選擇。
　　為了探索更靈敏更穩(wěn)定的檢測(cè)方法,本研究又進(jìn)一步關(guān)注了LF的酶活性。LF作為炭疽致死毒素的酶活性組份,在進(jìn)入細(xì)胞后具有Zn2+依賴的金屬蛋白酶活

9、性,能夠特異地切割MEK蛋白家族的成員。目前,已有多項(xiàng)在研的針對(duì)這一性質(zhì)的LF檢測(cè)方法,但這些研究往往需要利用質(zhì)譜、高效液相色譜等復(fù)雜的技術(shù)和設(shè)備。本研究期望在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出一套既靈敏又簡(jiǎn)單的LF檢測(cè)方法。
　　本研究將MEK中LF的酶切位點(diǎn)部分對(duì)應(yīng)的DNA序列添加到大腸桿菌堿性磷酸酶(AP)野生型或突變體的編碼基因的上游,并在融合蛋白的N端添加多聚組氨酸標(biāo)簽(His標(biāo)簽),成功構(gòu)建了融合蛋白MEKAP的重組表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行了表達(dá)純

10、化。將得到的MEKAP用于LF的檢測(cè):通過(guò)一系列類似于酶聯(lián)免疫吸附法的操作,實(shí)現(xiàn)了對(duì)LF的檢測(cè)。本研究設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法不需要質(zhì)譜儀、高效液相色譜等復(fù)雜設(shè)備,其操作流程簡(jiǎn)單,可檢測(cè)到31ng的目的蛋白,顯示了較好的應(yīng)用前景。
　　綜上所述,本研究首先建立了簡(jiǎn)便高效的LF制備工藝,在此基礎(chǔ)上,利用LF的細(xì)胞毒性和酶活性,對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行了探索:利用小鼠巨噬細(xì)胞J744A.1對(duì)LF細(xì)胞毒性的敏感性,建立了基于細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)LF的方法,并