動物類藥材中真菌毒素的檢測方法研究.pdf

1、真菌毒素(Mycotoxin)是真菌產(chǎn)生的一類有毒次級代謝產(chǎn)物，易污染食品、農(nóng)作物及飼料等產(chǎn)品。常見的幾種真菌毒素有黃曲霉毒素(aflatoxins，AF)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZON)、赭曲霉毒素A(ochratoxin，OTA)、伏馬菌素(fumonisins)等，具有強(qiáng)烈的毒性和致畸、致癌、致突變等作用，嚴(yán)重威脅人類與動物的健康。隨著人類對各種外源性污染的認(rèn)識，中藥安全性問題逐漸引起了社會的重視。動物藥是指用動物

2、的整體或某一部分作為藥用部位的一類中藥，在采集、加工、運(yùn)輸、貯藏等過程中，如果條件不當(dāng)，均有可能發(fā)生霉變，污染真菌毒素。因此，為了保證人民的用藥安全，很有必要對動物類藥材中污染的真菌毒素進(jìn)行研究，建立毒素的檢測方法，為其制訂合理的限量標(biāo)準(zhǔn)，以保證動物類藥材的安全有效。
　　目前，真菌毒素研究大多限于食品、飼料、農(nóng)作物、植物藥材等，建立了多種分析方法，各國相繼制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。但對動物藥材中真菌毒素的研究，少有報道。本文以自然條

3、件下污染最頻繁的黃曲霉毒素(AF)，玉米赤酶烯酮(ZON)及其代謝物α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)為代表，建立了動物藥材中AF、ZON和α-ZOL毒素的高效液相色譜-熒光檢測及串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。主要的研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　(1)建立了動物藥材中AF的高效液相色譜-熒光檢測方法(HPLC-FLD)。
　　動物類藥材經(jīng)甲醇-水(80:20，v/v)混合溶劑提取、水稀釋、免疫親和柱(IAC)凈化、柱后光化學(xué)衍生后，采用HPLC

4、-FLD法檢測樣品中黃曲霉毒素的含量。色譜柱：PRONTOSIL KROMAPLUS100-5-C18柱，流動相：甲醇-水(45:55，v/v)，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：25μL，柱溫：25℃；激發(fā)波長(Ex)：360 nm，發(fā)射波長(Em)：440nm。該方法AFB1、AFG1的線性范圍為1～75ng/mL，相關(guān)系數(shù)分別為0.9998、1.0000，AFB2、AFG2的線性范圍為0.3～22.5ng/mL，相關(guān)系數(shù)分別為0.9

5、998、0.9999。在1.50μg/kg添加水平下，不同動物藥材基質(zhì)AF的回收率為78.8％～106.7％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于7.1％。AFG2、AFG1、AFB2、AFB1的檢出限分別為0.15、0.25、0.1、0.2μg/kg。采用該方法對17種動物藥材樣品進(jìn)行分析，其中兩個樣品呈現(xiàn)陽性結(jié)果，AF污染水平為1-6.4μg/kg。結(jié)果表明該方法操作簡單、可靠、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可用于動物藥材中AF的檢測。
　　(2

6、)建立了動物藥材中AF的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法(LC-MS/MS)。
　　動物類藥材經(jīng)甲醇-水(80:20，v/v)提取、免疫親和柱凈化后，采用LC-MS/MS測定其中4種黃曲霉毒素的含量，以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式分別監(jiān)測離子對m/z331→245(AFG2，CE40 eV)，m/z329→243(AFG1，CE38 eV)，m/z315→259(AFB2，CE43 eV)和m/z313→241(AFB1，CE50 eV

7、)。AFB1、AFG1的線性范圍為0.1～200 ng/mL，相關(guān)系數(shù)均為0.9976，AFB2、AFG2的線性范圍為0.06～60ng/mL，相關(guān)系數(shù)分別為0.9975、0.9988。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的檢測限分別為0.03、0.02、0.03和0.02μg/kg，不同基質(zhì)三個加樣水平的回收率為86.4％～100.9％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于7.2％。結(jié)果表明該方法靈敏、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于復(fù)雜動物藥材基質(zhì)中

8、AF的檢測。
　　(3)建立了同時檢測蝗蟲藥材中AF、ZON、α-ZOL的HPLC-FLD法及其液質(zhì)確證的方法。
　　蝗蟲藥材經(jīng)乙腈-水(84:16，v/v)提取、免疫親和柱凈化后，采用HPLC-FLD法測定其中AF、ZON、α-ZOL的含量。流動相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫程序：0～12 min，50％～68％A；12～25 min，68％A，流速：1 mL/min，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：50μL。熒光檢測波長：0～

9、12 min，激發(fā)波長：360 nm，發(fā)射波長440 nm；12～25 nim，激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長460 nm。建立的方法具有專屬性強(qiáng)，線性范圍好，回收率高的特點。AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、α-ZOL與ZON的檢測限分別為0.04、0.10、0.02、0.04、6.6和8.6μg/kg，定量限分別為0.14、0.32、0.07、0.14、19.1和27.6μg/kg。采用該方法分析了11批蝗蟲藥材，發(fā)現(xiàn)AF的污