番茄抗葉霉病Cf-12候選基因的篩選及抗性應(yīng)答機制分析.pdf

1、番茄(Solanum lycopersicum)作為我國乃至世界上重要的蔬菜作物，其在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)以及人們的日常生活中扮演著重要的角色。然而在番茄保護地栽培日常生產(chǎn)過程中易受到多種病原物的侵?jǐn)_，尤其在我國中部番茄主產(chǎn)區(qū)夏季高溫高濕的栽培環(huán)境下極易引起番茄葉霉病的大面積發(fā)生，造成果實產(chǎn)量、品質(zhì)的嚴(yán)重下降，威脅當(dāng)?shù)胤训陌踩a(chǎn)。葉霉病菌（Cladosporium fulvum[syn.Passalora fulva]）與番茄植株發(fā)生的親和

2、性互作是番茄葉霉病發(fā)生的根源，因此以葉霉病抗性基因Cf為主導(dǎo)的抗葉霉病育種工作便成為工作的重點。目前，已鑒定出Cf-1、Cf-2、Cf-4、Cf-4E、Cf-5、Cf-9、Cf-11、Cf-9DC以及多個Cf-ECPs抗性基因，并成功的將Cf-4、Cf-5、Cf-9應(yīng)用于生產(chǎn)。含Cf基因的番茄能夠抵抗C.fulvum的關(guān)鍵在于，Cf基因編碼的類受體蛋白能夠特異性識別C.fulvum所分泌的效應(yīng)因子，從而介導(dǎo)植株產(chǎn)生HR(Hypersen

3、sitive response)。但目前存在的新問題是，隨著具不同Cf基因的商業(yè)番茄品種的長期、大面積推廣栽培，C.fulvum生理小種也發(fā)生了選擇性的激烈分化，其中新近發(fā)現(xiàn)的C.fulvum小種24克服了Cf-2、Cf-4基因的抗性，C.fulvum小種2.5和2.5.9克服了Cf-5、Cf-9基因的抗性，這些具有廣譜或者復(fù)合毒性的C.fulvum生理小種使其對應(yīng)的番茄抗病品種失去抗病性，同時也使番茄主產(chǎn)區(qū)C.fulvum小種的流行趨

4、勢變的更加多態(tài)化。為此，急需挖掘新的、抗性更廣更強的Cf基因應(yīng)用于生產(chǎn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Cf基因都來源子野生番茄，因此挖掘新的Cf抗性基因，并通過轉(zhuǎn)基因或者遠(yuǎn)緣雜交等手段，將Cf基因?qū)敕殉Ｒ?guī)栽培種，繼而培育出具葉霉病抗性的植株是番茄抗葉霉病育種的關(guān)鍵。通過多年的、多地的抗病性鑒定，CGN7495材料具有優(yōu)良的C.fulvum抗性，由Kanwar的鑒定結(jié)果得知該材料含有Cf-12基因，來源于醋栗番茄（L.pimpinellifolmm），該

5、基因目前并沒有研究基礎(chǔ)。因此，本試驗主要以番茄葉霉病新抗性候選基因Cf-12的挖掘和篩選，以及Cf-12對C.fulvum的抗性應(yīng)答機制為主要研究重點，同時也對Cf-12與C.fulvum非親和互作的組織學(xué)特征和抗性遺傳規(guī)律進行了分析。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴對Cf-12抗性番茄材料與C.fulvum的非親和互作過程的詳細(xì)的顯微觀察，明確了Cf-12抵御C.fulvum侵染的組織學(xué)特征，如C.fulvum孢子在抗性和感病材料上

6、的萌發(fā)以及從葉背氣孔侵入的過程并沒有表現(xiàn)出差異性，但是當(dāng)C.fulvum菌絲侵入Cf-5、Cf-12等的抗性材料氣孔2d后便停止生長，且菌絲腫脹、彎曲，與寄主葉肉細(xì)胞接觸的菌絲和葉肉細(xì)胞彼此都相繼崩潰，從而將C.fulvum侵入的菌絲限制在一個很小的有限空間內(nèi)，使其無法再侵染，且葉片上壞死斑點的產(chǎn)生逐漸增多和擴大。將Cf-12與Cf-5等基因?qū).fulvum的抗性特征進行了比較分析后，發(fā)現(xiàn)不同的Cf基因?qū).fulvum的抗性組織學(xué)特

7、征差異表現(xiàn)在過敏性壞死斑點的發(fā)生數(shù)量和面積等方面。⑵Cf基因?qū).fulvum的抗性范圍調(diào)查結(jié)果表明，不同的Cf基因能夠抵抗的C.fulvum生理小種的種類也具有較大差異，含Cf-12基因的番茄材料能夠抵御1.2、1.2.4、1.5、1.2.4.5、1.2.5、1.2.4.9等多種C.fulvum生理小種的侵染，但并不抗生理小種1.2.3.4，抗性范圍的明確對含Cf-12基因番茄有針對性的在不同C.fulvum生理小種流行區(qū)合理種植提供

8、參考。⑶依據(jù)構(gòu)建的S.pennellii LA0716與CGN7495的6世代群體，對群體中Cf-12基因的抗性遺傳規(guī)律的分析結(jié)果表明，F(xiàn)2群體中Cf-12基因的分離比符合3∶1的分離定律，BC1P1群體中Cf-12基因的實際分離比符合1∶1的孟德爾分離定律，由此可知Cf-12基因?qū).fulvum的抗性符合單基因顯性遺傳規(guī)律，這與已鑒定的其它Cf基因為單基因顯性遺傳的規(guī)律相一致。⑷在明確Cf-12基因為單基因顯性遺傳的基礎(chǔ)上，通過采用

9、父母本重測序，F(xiàn)2代抗、感群體SLAF簡化測序技術(shù)進行基于ED(Euclidean Distance)和SNP-index的聯(lián)合分析，對番茄葉霉病抗性基因Cf-12進行篩選，并成功將其關(guān)聯(lián)到番茄第6號染色體，對目標(biāo)關(guān)聯(lián)區(qū)域所包含基因進行NR、NT、trEMBL、Swiss-prot、GO、KEGG和COG等多數(shù)據(jù)庫的功能注釋和LRR-TM-sCT結(jié)構(gòu)預(yù)測確定了3個候選基因，在進一步通過Proparam、pfam、SMART、Signal

10、P、ProtComp、SOPMA、Swiss-Model等程序?qū)蜻x基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、二級和三級結(jié)構(gòu)、PPI網(wǎng)絡(luò)進行了詳細(xì)分析，以及基于qRT-PCR的表達模式分析和共表達分析的基礎(chǔ)上，確定位于CGN7495抗性材料上Solyc06g00820.2基因位點的72 bp堿基片段插入后的基因，即Ccg2基因為所篩選的Cf-12基因。此外，通過對番茄全基因組進行GO分類中定義為結(jié)合活性功能(GO:0005515)且具

11、有eLRR-TM結(jié)構(gòu)的基因進行番茄全基因組搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)已報道的所有Hcr2s、Hcr9s及Cf-Ecp基因均被覆蓋到，這一思路可為研究其它未知的Cf基因的定位工作提供新的途徑。⑸對Cf-12對C.fulvum的抗性應(yīng)答機制研究，采用基于高通量測序的RNA-seq技術(shù)，對多時間點的非親和互作樣本進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，通過對測序樣本間差異表達基因(DEGs)的k-mean聚類分析，總共發(fā)現(xiàn)了3類表達模式，其中最值得注意的是subcluster

12、4中持續(xù)高表達的34個DEGs，以及subcluster3中先低表達后又劇烈高表達的41個DEGs，GO分析顯示它們富集于氧化還原、氮代謝、磷代謝、結(jié)合活性、轉(zhuǎn)移酶活性、激素應(yīng)答、離子轉(zhuǎn)運以及防御反應(yīng)相關(guān)等類別，這對于后續(xù)試驗中篩選特異性表達的基因起到重要的輔助作用;可變剪接分析(AS)顯示，非親和互作過程主要發(fā)生SE和MXE事件，隨著時間的延長SE和MXE兩AS事件的總數(shù)量呈現(xiàn)增加的趨勢，說明這些顯著差異的可變剪接在Cf-12基因調(diào)控

13、對C.fulvum抗性的轉(zhuǎn)錄水平的基因表達的復(fù)雜程度以及蛋白質(zhì)功能的多樣性正在發(fā)生巨大的變化;GO和Pathway分析表明苯丙氨酸代謝途徑、植物—病原菌互作、苯丙烷生物合成、谷胱甘肽代謝，次生代謝產(chǎn)物的生物合成等生物過程中的基因被上調(diào)顯著富集，對植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析表明SA和ET對Cf-12的抗病防衛(wèi)反應(yīng)起重要的調(diào)控作用，而JA可能在Cf-12對C.fulvum的抗病防衛(wèi)反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到交叉、輔助的作用。此外，還富集到大量的氧

14、化物酶體，谷胱甘肽過氧化物酶基因，植保素合成基因，與苯丙素和黃酮類代謝途徑相關(guān)的苯丙氨酸懈氨酶基因、4CL、TC4M、F5H，有關(guān)黃酮類合成的CHSs、CHI、DFR、FLS，與細(xì)胞壁合成相關(guān)的纖維素合成酶基因和果膠酶活性的果膠（甲）酯酶基因等也均被富集到呈現(xiàn)上調(diào)表達的趨勢,與蛋白泛素化相關(guān)的E1、E2、E3等多數(shù)基因呈上調(diào)表達趨勢，說明蛋白的泛素化被積極響應(yīng)，總的來看與SA和ET、PR蛋白、植保素、防衛(wèi)素、硫堇、木質(zhì)素、滲調(diào)蛋白、過氧

15、化物酶以及黃酮類等的大量合成以及細(xì)胞壁的加強都使得Cf-12番茄對C.fulvum產(chǎn)生較好的抗性;在轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的分析中，首次發(fā)現(xiàn)多個新的ARF、MADS、G2-like、G3H、C2H2、bHLH等TFs家族參與到Cf-12對C.fulvum的抗性防衛(wèi)反應(yīng)中，且檢測到的這60個TFs家族呈現(xiàn)兩種表達模式，如bZIP、C2H2、HSF、MADS、NAC等在早期階段先上調(diào)表達，然后在后期下調(diào)表達，而bHLH、GRAS、HB、SBP、

16、MYB、WRKY等在抗性反應(yīng)的后期呈高表達的趨勢;通過全面的Cf-12對C.fulvum非親和互作的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，對Cf-12與C.fulvum的抗性應(yīng)答機制也有了一定的了解。⑹對Cf-12與C.fulvum抗性應(yīng)答反應(yīng)中的部分基因的VIGS的初步功能驗證，Ccg2候選基因以及NPR1（Solyc07g044980.2）、CDPK（Solyc03g113390.2）基因沉默后的部分植株出現(xiàn)了感病癥狀，病情指數(shù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)沉默NPR1和CDP