山東省番茄葉霉病菌及相似種的鑒定和番茄葉霉病菌ISSR-PCR體系建立.pdf

1、葉霉病是番茄生產(chǎn)上的重要病害。本文從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩方面對番茄葉霉病菌及其相似種進行了種類鑒定，建立了番茄葉霉病菌的ISSP-PCR優(yōu)化體系，并進行了引物篩選和菌株的遺傳多樣性分析。研究結(jié)果如下:
　　 (1)在2008-2009年間，在山東省的14個市、縣、鎮(zhèn)的主要番茄產(chǎn)區(qū)，采集不同番茄品種的葉霉病病葉標(biāo)樣，采用改進的單孢分離的方法對各個樣品進行分離純化，共得到21個菌株，根據(jù)培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征并結(jié)合rDNA-ITS序列

2、分析對其進行鑒定，其中19個菌株為同一個種，即黃釘孢Passalorafulva(Cooke)U.Braun&Crous，其余2個菌株分別為枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides(Fresen.)G.A.deVries和球孢枝孢CladosporiumsphaerospermumPenz。
　　 (2)番茄葉霉病菌培養(yǎng)基篩選結(jié)果表明，在PDA、OA、MEA和V8汁4種固體培養(yǎng)基以及PD、PS、V8汁3種液

3、體培養(yǎng)基中，MEA為最適宜的固體培養(yǎng)基，V8汁液體培養(yǎng)基為最適宜的液體培養(yǎng)基。
　　 (3)番茄葉霉病菌基因組DNA提取方法比較試驗表明:CTAB法效果最佳，SDS-CTAB法次之，尿素法效果最差。
　　 (4)本文首次建立了番茄葉霉病菌的ISSP-PCR優(yōu)化體系。以番茄葉霉病菌Passalorafulva基因組DNA為模板，采用單因素試驗和正交設(shè)計試驗對該菌ISSR-PCR體系中的一些重要參數(shù)（Mg2+、dNTPs、引

4、物、模板DNA、TaqDNA聚合酶、緩沖液、循環(huán)次數(shù)）進行優(yōu)化，并對退火溫度進行了梯度優(yōu)化，建立了番茄葉霉病菌ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系，20μL反應(yīng)體系中，Mg2+濃度1.5mM，dNTPs濃度0.4mM，引物1.5μM，模板DNA45ng，TaqDNA聚合酶1.5U，1倍的PCR緩沖液，循環(huán)次數(shù)為40次，退火溫度為50℃。
　　 (5)從100條ISSR通用引物中篩選出10個擴增條帶清晰、重復(fù)性好及多態(tài)性高的引物，并進行