低氧誘導因子1α（HIF-1α）在喉鱗癌中的表達及其臨床意義的研究.pdf

1、缺氧是人類和動物實體腫瘤的一個共同特征。低氧誘導因子1a(hypoxiainduciblefactor1α，HIF-1α)是機體在低氧條件下產(chǎn)生的一轉(zhuǎn)錄活化因子，它能指導多種低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，為機體適應(yīng)低氧，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一個重要因素。當周圍環(huán)境的氧濃度下降時，HIF-1α表達增加，并且其表達增加表現(xiàn)在多個水平上，包括轉(zhuǎn)錄和蛋白等水平，但主要是蛋白水平明顯增多。HIF-1α是HIF-1的一個亞基，是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位，HIF-1α的

2、活性是HIF-1的決定性成分，其活性對維持腫瘤細胞的能量代謝、新生血管形成以及促進腫瘤的增殖生長、侵襲和轉(zhuǎn)移起著重要作用，并受多種因子的調(diào)控和影響。在多種惡性腫瘤中都存在HIF-Ⅰα蛋白的過表達，并與預(yù)后不良密切相關(guān)。HIF-1α與腫瘤的關(guān)系已成為近年來腫瘤學研究中的一個新的熱點。有關(guān)HIF-1α與喉鱗癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究，目前國內(nèi)尚未見報道。本實驗首先從人喉鱗癌實體瘤入手，應(yīng)用免疫組織化學技術(shù)了解缺氧誘導因子1α(HIF-1α)極其相

3、關(guān)調(diào)控因子與喉鱗癌生物學行為的關(guān)系；進而通過體外細胞培養(yǎng)，從分子水平探討低氧條件下，缺氧誘導因子1α(HIF-1α)及其相關(guān)調(diào)控因子在頭頸腫瘤中的表達及相互作用機制，進一步明確HIF-1α與化療抵抗的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上進行靶向HIF-1α活性及表達的實驗，深入探討以缺氧為靶點對治療頭頸腫瘤及化療增敏的潛在臨床價值。 方法： 1HIF-1α在喉鱗癌中的表達及其與喉鱗癌生物學行為的關(guān)系。標本選自河北醫(yī)科大學病理教研室2001年

4、1月1日-2004年12月31日術(shù)前未經(jīng)治療的喉聲門上型癌、喉咽癌病人63例標本，其中男59例，女4例；中位年齡56歲(43～72歲)。根據(jù)國際抗癌協(xié)會(UICC)標準(1997)確定TNM分期。喉癌分型：喉聲門上型癌42例，喉咽癌21例；臨床分期：Ⅰ期8例Ⅱ期11例、Ⅲ期14例、Ⅳ期30例；病理學分級：鱗癌Ⅰ級15例，鱗癌Ⅱ級29例、鱗癌Ⅲ級19例；病理證實頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組41例，無轉(zhuǎn)移組22例。取癌旁正常粘膜組織20例作為對照。所有

5、標本均一部分迅速置于液氮罐中保存，一部分標本離體后2小時內(nèi)放入10％中性福爾馬林中固定24小時，石蠟包埋，常規(guī)病理HE染色，所有標本均經(jīng)兩位副高以上職稱的病理科醫(yī)生確定病理性質(zhì)和病理學分級。腫瘤組織均病理證實為鱗狀細胞癌，喉癌旁正常粘膜病理為正常喉組織。 1.1免疫組織化學染色方法對喉鱗癌63例標本進行檢測，其中病理證實頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組41例，無轉(zhuǎn)移組22例。取癌旁正常粘膜組織20例作為對照。指標為HIF-1α、VEGF、P53

6、。結(jié)果判定：每例標本以400倍光鏡下隨意選取10個視野，計數(shù)每個視野中100個腫瘤細胞中的陽性細胞數(shù)，取其平均數(shù)求其陽性百分率作為結(jié)果。平均陽性細胞所占比例≤5％判定為陰性，陽性染色細胞＞5％判定為陽性。 1.2流式細胞儀對轉(zhuǎn)移組患者的原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶以及非轉(zhuǎn)移組標本檢測HIF-1α、VEGF、P53蛋白表達進行定量分析，取石蠟標本切片(40μm厚)，網(wǎng)搓法制備單細胞樣品。在對蛋白免疫熒光標記物測定時，設(shè)一抗或二抗的本底對照

7、和陰性對照。采用美國BeckmanCoulter公司生產(chǎn)地Epics-XLⅡ型流式細胞儀進行檢測。以熒光指數(shù)(FI)表示蛋白表達產(chǎn)物的相對含量，F(xiàn)I=(瘤細胞表達的平均熒光強度/正常對照樣品平均熒光強度)。熒光指數(shù)(FI)可相對客觀的反映蛋白的表達程度。 1.3用TrizolReagant進行組織總RNA提取，采用RT-PCR試劑盒對提取的總RNA進行RT-PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在紫外凝膠投射分析系統(tǒng)中

8、照相分析，分別比較HIF-1αmRNA在喉鱗癌組織和癌旁正常粘膜組織中的表達水平，分析其基因表達調(diào)控水平。 2低氧對喉鱗癌細胞系Hep-2HIF-1α及其相關(guān)基因表達的影響：人喉鱗癌細胞Hep-2分成3組：缺氧12h組、缺氧24h組及對照組。缺氧組分別在缺氧條件下(37℃，5％CO2，2％O2飽和度)培養(yǎng)12h和24h，對照組置于正常氧濃度條件下(37℃，5％CO2、21％O2飽和度)培養(yǎng)24h。流式細胞儀分別測定3組細胞周期及

9、HIF-1α、突變型P53、VEGF表達，免疫組織化學SP法分別測定3組細胞缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、P53、VEGF表達。RT-PCR檢測各組細胞HIF-1αmRNA的表達水平。 結(jié)果： 1HIF-1α在喉鱗癌中的表達及其與喉鱗癌生物學行為的關(guān)系。 1.1免疫組化染色結(jié)果顯示(1)HIF-1α蛋白在癌旁正常喉黏膜中幾乎無表達，在喉鱗癌組織中主要于細胞胞漿中可見致密濃染的棕色顆粒，部分切片顯示其在胞漿及胞

10、核中均有表達。(2)有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HIF-1α蛋白表達(82.9％)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(54.5％)(P＜0.05)。(3)HIF-1α蛋白表達與喉鱗癌病理分級及臨床分期相關(guān)。(4)喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中原發(fā)灶HIF-1α蛋白表達陽性率為82.9％低于其淋巴結(jié)表達的陽性率95.1％，但經(jīng)X2檢驗二者無明顯差異(P＞0.05)。(5)轉(zhuǎn)移組原發(fā)灶HIF-1α蛋白表達與喉癌、下咽癌臨床分期和病理分級有關(guān)(P＜0.05)；轉(zhuǎn)移組淋巴結(jié)HIF

11、-1α蛋白表達與喉癌、下咽癌臨床分期及病理分級均無關(guān)(P＞0.05)。(6)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF、P53蛋白表達陽性率(70.7％，68.3％)高于非轉(zhuǎn)移組(40.9％，36.4％)(P＜0.05)；⑦喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)VEGF、P53蛋白表達陽性率(87.8％，80.5％)均高于其原發(fā)灶(70.7％，68.3％)，但經(jīng)X2檢驗二者無明顯差異(P＞0.05)。 1.2流式細胞儀對轉(zhuǎn)移組患者的原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶以及非

12、轉(zhuǎn)移組標本檢測HIF-1α、VEGF、P53，結(jié)果顯示(1)轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組腫瘤細胞HIF-1α蛋白表達的平均FI分別為5.33±0.16和2.27±0.18，t檢驗顯示兩者間差異有統(tǒng)計學意義(t=1.36，P＜0.05)。(2)轉(zhuǎn)移組原發(fā)灶與其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)腫瘤細胞HIF-1α蛋白的平均FI分別為5.33±0.16和10.53±1.1，配對t檢驗顯示兩者間差異有統(tǒng)計學意義(t=10.36，P＜0.05)。(3)喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF、

13、P53蛋白表達的平均FI高于非轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。(4)經(jīng)Pearson相關(guān)檢驗分析，非轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組HIF-1α與VEGF表達均呈正相關(guān)(r=0.715，0.883,P＜0.05)，HIF-1α與P53表達亦呈正相關(guān)(r=0.725,0.852，P＜0.05)。(5)喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組原發(fā)灶與其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)VEGF、P53蛋白表達平均FI轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)均高于原發(fā)灶，P＜0.05。(6)在喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組原發(fā)灶與其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中HIF-1

14、α與VEGF表達均呈正相關(guān)(r=0.715,0.686,P＜0.05)，HIF-1α與P53表達亦呈正相關(guān)(r=0.755,0.823,P＜0.05)。 1.3RT-PCR檢測HIF-1αmRNA在喉癌組織中的表達，在63例喉鱗狀細胞癌中有46例HIF-1αmRNA呈陽性表達，在487bp處可見清晰條帶，在20例正常喉粘膜組織中16例HIF-1αmRNA呈陽性表達，二者在統(tǒng)計學無顯著差異。 2低氧對喉鱗癌細胞系Hep-2

15、HIF-1α及其相關(guān)基因表達的影響 2.1免疫細胞化學SP法檢測低氧組Hep2細胞胞漿中呈陽性表達，且隨著缺氧時間延長表達增強。 2.2缺氧12h組、缺氧24h組及對照組HIF-1α免疫熒光指數(shù)分別為：1.69±1.21，5.83±1.28，0.22±0.07；上述三組P53免疫熒光指數(shù)分別為：2.75±0.02，5.27±0.07，1.15±0.01；上述三組VEGF免疫熒光指數(shù)分別為：4.85±0.03，10.37±

16、0.2，2.15±0.06；經(jīng)F檢驗，3組間的差異均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。 2.3流式細胞儀測定缺氧組HIF-1α與P53表達呈明顯正相關(guān)性(r=0.715,P＜0.05)，HIF-1α與VEGF表達呈明顯正相關(guān)性(r=0.925，P＜0.05)。 結(jié)論： 1應(yīng)用免疫組化技術(shù)、流式細胞技術(shù)、RT-PCR技術(shù)對人喉鱗癌63例標本分別從HIF-1α蛋白表達水平定性、定位及定量、HIF-1α基因水平表達等不同側(cè)面

17、研究表明，HIF-1α與喉鱗癌轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理分級密切相關(guān)，并在腫瘤血管生成以及篩選抗凋亡細胞中與VEGF、P53等相關(guān)調(diào)控因子協(xié)同作用促進了腫瘤發(fā)展的惡性進程。尤其是腫瘤乏氧情況下，P53基因突變或缺失時可增加癌細胞對抗癌藥誘導的凋亡的耐受力，因此推測乏氧以及乏氧造成的P53基因突變率增加是造成喉鱗癌細胞治療抵抗的重要影響因素，這—研究結(jié)果為進一步體外實驗探討喉鱗癌治療抵抗機制奠定了重要基礎(chǔ)。 2體外低氧實驗結(jié)果表明，缺氧