不同栽培品種橘的主要藥效成分動(dòng)態(tài)變化與遺傳多樣性分析研究.pdf

1、中藥陳皮來(lái)源于蕓香科Rutaceae柑橘屬Citrus L.植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。橘的栽培品種較多，地域分布廣泛，我國(guó)長(zhǎng)江以南各省均有栽培，作為陳皮來(lái)源品種的橘類(lèi)植物主要為寬皮柑橘類(lèi)，栽培品種有茶枝柑C.reticulata?Chachi‘、紅橘C. tangerina Hort. et Tanaka、樟頭紅C. reticulata Blanco cv.zhangshuens

2、is Hort、南豐蜜橘C. reticulata Blanco cv. Kinokuni、福橘C.reticulata?Tangerina‘等，主產(chǎn)于廣東、四川、重慶、江西、福建等地。
　　陳皮是中藥多栽培品種入藥的代表藥物，近年來(lái)由于柑橘品種不斷更新交替以及栽培更重視其食用價(jià)值，加之2010年版《中國(guó)藥典》對(duì)陳皮來(lái)源橘的栽培變種未作進(jìn)一步規(guī)定，藥典收載的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也無(wú)法客觀評(píng)價(jià)各栽培變種的品質(zhì)差異，造成陳皮傳統(tǒng)來(lái)源品種大紅袍等面

3、臨淘汰，而一些藥用質(zhì)量未經(jīng)評(píng)價(jià)的柑橘品種以“雜陳皮”流通于市場(chǎng)，導(dǎo)致陳皮藥材質(zhì)量問(wèn)題突出，臨床療效難以保證。因此，亟需對(duì)市場(chǎng)上流通的陳皮入藥品種的遺傳差異、化學(xué)成分、藥理作用等進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)研究，為進(jìn)一步規(guī)范陳皮入藥品種，確保陳皮藥材質(zhì)量穩(wěn)定可控和臨床用藥安全有效提供科學(xué)依據(jù)。本文首次對(duì)川陳皮傳統(tǒng)來(lái)源品種大紅袍 C. reticulata?Dahongpao‘(紅橘品系)、贛陳皮來(lái)源品種南豐蜜橘和樟頭紅中主要藥效成分—黃酮、總酚酸、生物堿

4、、多糖含量在不同采收期內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，明確不同藥效成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為選擇陳皮入藥品種的次生代謝產(chǎn)物的等同性研究奠定基礎(chǔ)；并對(duì)大紅袍果實(shí)發(fā)育期(7～12月份)內(nèi)葉片和果皮中黃酮類(lèi)成分的合成積累與3種次生代謝關(guān)鍵酶(PAL、C4H、4CL)活性的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究，首次初步闡釋了大紅袍果實(shí)發(fā)育過(guò)程中黃酮類(lèi)成分生物合成代謝機(jī)制，揭示了陳皮成分積累與陳皮入藥成熟度的科學(xué)內(nèi)涵，為進(jìn)一步規(guī)范陳皮傳統(tǒng)入藥品種的采收加工提供依據(jù)；對(duì)陳皮傳統(tǒng)入藥

5、品種茶枝柑、大紅袍、南豐蜜橘及其市場(chǎng)上混雜入藥的柑橘品種天草 C. reticulata hybrid等22個(gè)柑橘品種的遺傳多樣性及DNA條形碼進(jìn)行研究，以期為陳皮種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和合理利用提供參考，也為陳皮入藥品種的進(jìn)一步篩選提供遺傳學(xué)依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1不同栽培品種陳皮藥材主要藥效成分動(dòng)態(tài)變化研究
　　本研究采用HPLC法測(cè)定不同采收期大紅袍、樟頭紅、南豐蜜橘中4種主要黃酮類(lèi)成分蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮

6、素、橘皮素和生物堿類(lèi)成分辛弗林的含量，UV分光光度法測(cè)定總黃酮、總酚酸和多糖的含量。結(jié)果表明：3個(gè)栽培品種中黃酮類(lèi)成分蕓香柚皮苷、川陳皮素、橘皮素和辛弗林均隨采收時(shí)間的推遲而逐漸降低至果實(shí)成熟時(shí)趨于穩(wěn)定。橙皮苷、總黃酮和總酚酸、多糖在整個(gè)采收期內(nèi)呈現(xiàn)起伏波動(dòng)的變化趨勢(shì)，橙皮苷、總黃酮和總酚酸在整個(gè)采收期內(nèi)的總體變化呈下降趨勢(shì)，橙皮苷和總黃酮在幼果期至果實(shí)成熟前含量均呈降低趨勢(shì)，在果實(shí)成熟后含量有所回升；總酚酸在果實(shí)膨大期至著色期含量變化

7、幅度較大，先迅速升高，后持續(xù)降至果實(shí)成熟時(shí)趨于穩(wěn)定；多糖在果實(shí)著色期前均持續(xù)升高至著色期后急劇下降，于成熟期含量大幅上升至最高水平。從各藥效成分在整個(gè)采收期內(nèi)的積累量來(lái)看，3個(gè)品種中黃酮類(lèi)成分蕓香柚皮苷的含量存在明顯差異，其積累量的相對(duì)高低為樟頭紅＞南豐蜜橘＞大紅袍；橙皮苷、總黃酮及其生物堿類(lèi)成分辛弗林的含量也存在明顯差異，其含量高低為南豐蜜橘＞大紅袍＞樟頭紅，而其它類(lèi)成分的積累量差異不明顯，原因可能與調(diào)控黃酮類(lèi)成分合成積累的次生代謝關(guān)

8、鍵酶的活性表達(dá)有關(guān)，具體的調(diào)控機(jī)制還有待繼續(xù)深入研究。該研究初步明確了3個(gè)栽培品種陳皮中主要藥效成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為進(jìn)一步選擇陳皮入藥品種的次生代謝產(chǎn)物的等同性研究奠定基礎(chǔ)。
　　2大紅袍葉片、果皮中黃酮類(lèi)成分積累的初步研究
　　對(duì)大紅袍、南豐蜜橘、樟頭紅中主要藥效成分的動(dòng)態(tài)變化研究表明，3個(gè)栽培品種中黃酮類(lèi)成分橙皮苷和總黃酮的含量隨果實(shí)發(fā)育期的推遲存在明顯差異。本研究首次以川陳皮來(lái)源品種大紅袍葉片和果皮為對(duì)象，對(duì)其果實(shí)發(fā)

9、育的幼果期至成熟期內(nèi)(7～12月份)葉片中黃酮類(lèi)成分積累與其次生合成代謝關(guān)鍵酶 PAL、C4H、4CL活性的相關(guān)性及其同期果皮中黃酮類(lèi)成分積累的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性進(jìn)行系統(tǒng)研究，共比較了40批大紅袍葉片和果皮樣品。
　　2.1大紅袍葉片中黃酮類(lèi)成分積累與其次生代謝3種關(guān)鍵酶的相關(guān)性研究
　　本研究在前期課題組研究基礎(chǔ)上建立了UPLC測(cè)定大紅袍葉片中橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量方法，對(duì)不同采收期內(nèi)大紅袍葉片中3種主要黃酮類(lèi)成分的含量進(jìn)

10、行測(cè)定，并運(yùn)用UV分光光度法追蹤測(cè)定了葉片中黃酮類(lèi)成分合成代謝的3種關(guān)鍵酶PAL、C4H、4CL活性和總黃酮的含量，分析黃酮類(lèi)成分積累與3種關(guān)鍵酶活性的關(guān)系。結(jié)果表明：大紅袍葉片中橙皮苷和總黃酮的積累與 PAL、C4H活性從果實(shí)發(fā)育的幼果期到膨大期內(nèi)呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，橙皮苷和總黃酮的含量逐漸增加，PAL、C4H酶的活性也逐漸升高，從果實(shí)著色期至成熟期出現(xiàn)了分化，橙皮苷和總黃酮含量持續(xù)升高，而 PAL、C4H活性持續(xù)降低，而在整個(gè)采收期

11、內(nèi)二者含量與4CL酶活性之間沒(méi)有明顯的關(guān)系；4CL酶活性的變化與川陳皮素和橘皮素含量之間也呈現(xiàn)相似的變化，從果實(shí)膨大期至著色前期呈現(xiàn)先降低后升高的同步變化趨勢(shì)，之后從果實(shí)著色期至成熟期出現(xiàn)分化，川陳皮素和橘皮素含量升高，4CL酶活性降低，而在整個(gè)采收期內(nèi)二者含量與PAL、C4H酶活性的關(guān)系不明顯。大紅袍葉片中黃酮類(lèi)成分積累與3種次生代謝合成關(guān)鍵酶出現(xiàn)分化的具體原因可能與其栽培環(huán)境的變化及調(diào)控黃酮類(lèi)成分合成的其他關(guān)鍵酶活性的調(diào)控有關(guān)，其中

12、復(fù)雜的合成代謝調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。該研究初步揭示了大紅袍葉片中黃酮類(lèi)成分生物合成積累與PAL、C4H、4CL關(guān)鍵酶活性的關(guān)系，為研究大紅袍葉片中黃酮類(lèi)成分的合成代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　2.2大紅袍葉片與果皮中黃酮類(lèi)成分積累的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性研究
　　為進(jìn)一步深入研究大紅袍果皮中黃酮類(lèi)成分合成積累的代謝機(jī)制，本研究在對(duì)大紅袍葉片中黃酮類(lèi)成分合成積累研究的基礎(chǔ)上，對(duì)同期采集的大紅袍果皮中黃酮類(lèi)成分的積累進(jìn)行系統(tǒng)研究，利用HP

13、LC法測(cè)定了與葉片同期采收的大紅袍果皮中3種主要黃酮類(lèi)成分橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量，并運(yùn)用UV分光光度法測(cè)定其葉片中總黃酮的含量，分析大紅袍果實(shí)發(fā)育期內(nèi)大紅袍果皮和葉片中黃酮類(lèi)成分積累的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明：在大紅袍果實(shí)發(fā)育的幼果期到成熟期內(nèi)葉片和果皮中黃酮類(lèi)成分的變化趨勢(shì)不盡相同，在果實(shí)發(fā)育的膨大期到成熟期內(nèi)二者黃酮類(lèi)成分的積累變化較為明顯，呈現(xiàn)出增減互補(bǔ)的變化趨勢(shì)，葉片中橙皮苷和總黃酮的含量隨成熟度的增加逐漸升高，而果皮中橙皮

14、苷和總黃酮的含量逐漸降低，葉片中橘皮素和川陳皮素含量隨成熟度的增加緩慢升高，而果皮中則逐漸降低。該研究初步表明了大紅袍葉片和果皮中黃酮類(lèi)成分積累的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性，為闡釋大紅袍中黃酮類(lèi)成分積累與陳皮入藥成熟度的相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。
　　3不同栽培品種柑橘的遺傳多樣性分析研究
　　本研究對(duì)市場(chǎng)上流通的陳皮入藥品種進(jìn)行遺傳多樣性分析研究，為進(jìn)一步篩選陳皮入藥的柑橘品種提供遺傳學(xué)依據(jù)。采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)茶枝柑、福橘、大紅袍、南豐

15、蜜橘、樟頭紅、天草等22個(gè)柑橘品種進(jìn)行遺傳多樣性研究。結(jié)果表明：從12對(duì)EcoRⅠ/MseⅠ引物組合中篩選出6對(duì)引物，對(duì)樣本進(jìn)行PCR批量擴(kuò)增，經(jīng)高效毛細(xì)管電泳檢測(cè)得到的樣本DNA多態(tài)性條帶總數(shù)為472條，多態(tài)性比例達(dá)到80％以上，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出78條DNA多態(tài)性條帶，能夠較好地反映柑橘樣本間的遺傳信息。且基于遺傳相似性系數(shù)構(gòu)建的 UPGMA聚類(lèi)圖能夠?qū)⒉煌耘嗥贩N的茶枝柑、大紅袍、福橘、椪柑、臍橙、不知火、天草等各聚為一類(lèi)，其中同

16、一品種不同產(chǎn)地的茶枝柑、大紅袍、椪柑、臍橙、天草等各聚為一類(lèi)，表明品種間的遺傳差異受地域的影響較??；化學(xué)成分相似的南豐蜜橘和樟頭紅也單獨(dú)聚為一類(lèi)，與正品茶枝柑比較椪柑與其親緣關(guān)系最近，而毛氣柑與其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。以上研究結(jié)果顯示AFLP分子標(biāo)記能夠較好地界定劃分不同栽培品種的柑橘，從DNA水平上表征了柑橘各栽培品種的遺傳多樣性，建議在進(jìn)行陳皮入藥品種篩選時(shí)可以從與陳皮道地品種親緣關(guān)系較近的柑橘品種入手。
　　4不同栽培品種柑橘的DN

17、A條形碼初步研究
　　本研究以陳皮主要栽培品種茶枝柑、大紅袍、南豐蜜橘等13個(gè)柑橘品種為研究對(duì)象，以ITS2序列為基礎(chǔ)對(duì)其進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定分析研究。結(jié)果表明：基于K2P距離構(gòu)建的NJ發(fā)育樹(shù)不能較好地區(qū)分鑒定各陳皮栽培品種，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。原因在于陳皮來(lái)源植物寬皮柑橘的栽培品種之間普遍存在自然雜交和芽變現(xiàn)象，特別是經(jīng)雜交育種的雜柑(天草、不知火等)，其DNA片段上僅存在少數(shù)位點(diǎn)的單核苷酸變異，其ITS2序列存在高度相