泛素特異肽酶USP22促進(jìn)甲狀腺癌生長的機(jī)制研究.pdf

1、甲狀腺癌的發(fā)生率占全身惡性腫瘤的1％,且呈逐年增長趨勢。其中未分化甲狀腺癌是最有侵襲力的實(shí)體腫瘤之一,嚴(yán)重影響人類健康。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及甲狀腺癌研究領(lǐng)域的不斷深入,與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的癌基因和抑癌基因逐步被發(fā)現(xiàn),其參與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系也逐漸成為近年研究的熱點(diǎn)。
　　細(xì)胞泛素特異肽酶USP22是一個新的去泛素化酶,它可以從泛素結(jié)合蛋白底物剪切泛素。USP22位于人的第17號染色體的第14個外顯子。在真核生

2、物中,USP22作為hSAGA轉(zhuǎn)錄輔助因子復(fù)合物的酶亞單位發(fā)揮功能。有研究報道USP22可以調(diào)控細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控蛋白p21,USP22缺失會導(dǎo)致人類腫瘤細(xì)胞G1期細(xì)胞周期阻滯。Northern blot分析結(jié)果表明USP22在包括心臟、骨骼肌等多種組織里中度表達(dá),在肺和肝臟組織里弱表達(dá)。絲裂原活化或者T、B淋巴細(xì)胞的病毒感染可以刺激USP22的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞無限增殖,表明USP22基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。更為重要的是,USP

3、22被認(rèn)為是公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物之一,并且USP22表達(dá)的變化與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能和治療預(yù)后可能相關(guān)。然而,導(dǎo)致USP22激活,尤其是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍不清楚。
　　既往已經(jīng)有部分研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),USP22可以表達(dá)于許多腫瘤細(xì)胞核組織,且其在腫瘤中的表達(dá)通常高于正常細(xì)胞和組織,進(jìn)一步研究證實(shí),USP22與這些腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。因此,USP22是一個潛在的腫瘤促進(jìn)因子;然而,USP22在甲狀腺癌中的表達(dá)情況以及是否與甲狀腺

4、癌的發(fā)生有關(guān),目前尚未見相關(guān)研究報道,本課題將對USP22在甲狀腺癌中的表達(dá)情況,以及其與甲狀腺癌的增殖表型和預(yù)后進(jìn)行研究,進(jìn)一步探討甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,并為該分子為靶點(diǎn)開發(fā)新的甲狀腺癌抑制藥物和預(yù)后檢測指標(biāo)提供理論依據(jù)。
　　【目的】
　　1、研究USP22在甲狀腺癌中的表達(dá)情況和USP22對甲狀腺癌細(xì)胞生長的影響;2、探討USP22促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞生長的可能機(jī)制。
　　【方法】
　　1、檢測USP22

5、在甲狀腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。2、通過Western Blot檢測技術(shù)探討USP22在甲狀腺癌細(xì)胞系中的蛋白水平。3、構(gòu)建USP22的siRNA載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。構(gòu)建USP22的正義表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。4、鑒定不同載體的轉(zhuǎn)染效果。5、觀察并對比轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對照細(xì)胞的生長情況。6、通過流式細(xì)胞術(shù)觀察USP22表達(dá)的變化對甲狀腺癌細(xì)胞周期的影響。7、通過流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258染色方法探討USP2

6、2表達(dá)的變化對甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的影響。8、利用MTT實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法研究USP22表達(dá)的變化對甲狀腺癌細(xì)胞體外成瘤能力的影響。9、通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)探討USP22表達(dá)的變化對甲狀腺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。10、觀察USP22表達(dá)水平的變化對于甲狀腺癌細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)調(diào)控的作用。
　　【結(jié)果】
　　1、免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP22在甲狀腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織,甲狀腺癌的分化程度越低、臨床分期越差

7、則USP22的表達(dá)越高。2、USP22在正常細(xì)胞系中低表達(dá),而在甲狀腺癌細(xì)胞系中則高表達(dá)。3、成功構(gòu)建了USP22的siRNA載體和正義表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后成功建立了USP22下調(diào)及上調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞系。4、MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)腫瘤細(xì)胞中USP22的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞生長,而上調(diào)正常甲狀腺細(xì)胞系中USP22的表達(dá)則促進(jìn)正常甲狀腺細(xì)胞增殖。5、細(xì)胞周期檢測顯示,USP22可以促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞周期進(jìn)展。6、凋亡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),USP22

8、可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡。7、體外軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,下調(diào)USP22的表達(dá)可以明顯抑制甲狀腺癌細(xì)胞的生長。8、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,下調(diào)USP22的表達(dá)可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)成瘤能力。9、細(xì)胞周期相關(guān)分子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)USP22的表達(dá)可以降低PCNA、Cyclin D1和p-Rb的表達(dá),但增加了Rb的表達(dá);上調(diào)USP22的表達(dá)則顯著增加了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白PCNA、Cyclin D1和p-Rb的表達(dá)水平,同時下調(diào)了Rb的蛋白