雙黃補在牙周組織工程中對牙周組織再生修復的作用.pdf

1、目的:
　　 牙周炎是侵犯牙齦和牙周組織的慢性炎癥，是一種細菌感染的破壞性疾病，其主要特征為牙周袋的形成及袋壁的炎癥，牙槽骨吸收和牙齒逐漸松動。目前牙周病的治療方法很多，在臨床上雖取得了一定成效，但均未取得理想的效果。如何使牙周病治療獲得牙周新附著，實現(xiàn)牙周組織的再生修復，一直是人們努力的方向，近年來，牙周組織工程的出現(xiàn)及其技術的不斷完備，為牙周組織工程在牙周病的治療及牙周組織缺損再生修復方面提供了嶄新的研究空間。
　　

2、 牙周組織工程包括三大要素即具有增殖分化潛能的種子細胞、促進細胞增殖分化的生長因子以及利于細胞粘附生長的細胞外基質（支架）材料。牙周膜細胞(periodontalligamentcells，PDLCs)是牙周組織工程中理想的種子細胞，在適宜的刺激下，可分化為成纖維細胞、成骨細胞和成牙骨質細胞，實現(xiàn)牙周病變組織的再生修復，但PDLCs來源有限，須拔除一定量自體牙后才能獲得，且其培養(yǎng)成功率相對較低而不能被廣泛應用。目前研究發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細胞

3、在一定刺激下也具有一定的成骨表型，且因取材方便、創(chuàng)傷小、繁殖能力強、培養(yǎng)成功率高而成為牙周組織工程種子細胞研究的熱點。中草藥因對人體刺激小、毒副作用小等特點得到人們的關注，中藥雙黃補由黃連、黃芩、骨碎補按一定比例熬制而成，其中黃連提取物及黃芩提取物對牙周炎致病菌有明顯抑制作用，并且適當濃度的骨碎補也可增強牙齦成纖維細胞的繁殖能力及誘導其成骨表型。
　　 本實驗以雙黃補作為牙周組織工程中的生長因子，通過構建牙齦成纖維細胞（Ging

4、ivalfibroblasts，GF）-玉米醇溶蛋白支架(ZeinScaffold)-雙黃補復合體并應用于比格犬牙周缺損模型中，探討雙黃補在牙周組織工程中對牙周組織再生修復的作用，為雙黃補在臨床治療牙周病提供實驗依據(jù)和理論基礎。
　　 方法:
　　 1.牙齦成纖維細胞培養(yǎng)及來源鑒定
　　 將切取的Beagle犬頰側牙齦組織，轉移至無菌環(huán)境，DMEM沖洗3次，然后移入含少量DMEM的培養(yǎng)皿中，將其剪成1mm×1mm

5、×1mm大小的組織塊，采用改良組織塊法培養(yǎng)牙齦成纖維細胞。
　　 取生長狀態(tài)良好的第3代細胞，免疫組化ABC法進行波形絲蛋白和角蛋白染色鑒定其來源，PBS代替一抗作陰性對照，光鏡下觀察。
　　 2.玉米醇溶蛋白支架制備
　　 將玉米醇溶蛋白溶于酒精溶液后，加入氯化鈉致孔劑，采用溶劑澆鑄/粒子瀝濾法制備支架，將支架切成5mm×4mm×1mm大小，紫外線消毒2小時備用。
　　 3.雙黃補培養(yǎng)液的制備
　

6、　 將黃連、黃芩、骨碎補按一定比例混合，蒸餾水浸泡30min，分別加8倍體積及6倍體積的水煎煮兩次，水提醇沉法配制成1g/ml生藥的雙黃補煎液，活性炭脫色，調(diào)節(jié)PH值為7.0～7.1，濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 4.牙齦成纖維細胞-支架復合體及牙齦成纖維細胞-支架-雙黃補復合體制備
　　 37℃下，將玉米醇溶蛋白支架分別置于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液及含100μg/ml質量濃度的中藥雙黃補培養(yǎng)液的96孔板中

7、浸提24小時，取第4代生長良好的細胞，以1.5×105的細胞濃度接種于支架上，掃描電鏡下觀察細胞在支架粘附情況，以備用于動物實驗。
　　 5.動物實驗
　　 選用健康雄性清潔級Beagle犬2只，體重約15Kg，月齡6-12月，以每犬上頜54(⊥)45，下頜8743(⊥)3478作為手術部位，每組5個牙位，在每牙位頰側制備牙周缺損，分別將Zein支架、GF-Zein復合體及GF-Zein-雙黃補復合體植入相應牙位，空白對

8、照組不做任何處理，間斷縫合牙齦組織。術后3個月，取8(⊥)8標本行掃描電鏡觀察，其余標本行組織學觀察及測量（組織學測量指標:骨缺損高度、新生牙槽骨高度、新生牙骨質高度、結合上皮長度）以及免疫組織化學染色定量分析胰島素樣生長因子(insulinlikegrowthfactor-1，IGF-1)及骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的表達。
　　 6.統(tǒng)計學方法
　　 所有數(shù)據(jù)均以(X)±S表示，采用SPSS13.0統(tǒng)

9、計軟件進行統(tǒng)計學分析，采用方差分析比較各組缺損區(qū)牙槽骨生成的差異以及比較各組IGF-1和OPN陽性細胞率的差異，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.牙齦成纖維細胞培養(yǎng)及來源鑒定
　　 牙齦成纖維細胞大約在培養(yǎng)的第7天由組織塊游出，圍繞組織快周圍呈放射狀排列，細胞呈長梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，可見多個胞漿突，核圓形或卵圓形。
　　 經(jīng)免疫組織化學ABC法染色后，顯示抗波形蛋白染色陽性、抗角蛋

10、白染色陰性，證實為中胚層來源，符合成纖維細胞的特性，可用于實驗。
　　 2.牙齦成纖維細胞-支架復合體及牙齦成纖維細胞-支架-雙黃補復合體掃描電鏡觀察
　　 掃描電鏡下可見，雙黃補作用下粘附在玉米醇溶蛋白支架上的牙齦成纖維細胞數(shù)目較多，呈長梭形或星形，伸出偽足并橫跨孔隙交織成網(wǎng)狀。無雙黃補誘導作用下粘附在玉米醇溶蛋白支架上的細胞數(shù)目較少，多呈星形，且主要黏附生長在孔隙陷窩內(nèi)。
　　 3.牙體牙周聯(lián)合標本觀察

11、>　　 3.1組織學觀察
　　 術后3個月，GF-Zein-雙黃補復合體組與其余三組相比，牙周組織中炎癥細胞明顯減少，可見再生的牙槽骨及牙骨質。
　　 3.2組織學測量
　　 術后3個月，GF-Zein-雙黃補復合體組新生牙槽骨生長高度(1.16±0.06)mm較其余三組明顯增高(P＜0.05)。而新生牙骨質高度與結合上皮長度各組之間無顯著差別(P＞0.05)。
　　 3.3掃描電鏡觀察
　　

12、術后3個月，GF-Zein-雙黃補復合體組的再生牙槽骨較其余三組可見排列規(guī)則的骨小梁，趨于成熟的哈弗氏系統(tǒng)。
　　 3.4免疫組化行IGF-1及OPN定量分析
　　 術后3個月，GF-Zein-雙黃補復合體組新生牙槽骨周IGF-1的陽性細胞率(24.32±1.85)％高于其余組的陽性細胞率，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。GF-Zein-雙黃補復合體組新生牙槽骨周圍OPN的陽性細胞率(12.68±1.25)％與空白對照組相

13、比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而GF-Zein-雙黃補復合體組與GF-Zein復合體組及Zein組新生牙槽骨周圍OPN的陽性細胞率相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但是GF-Zein-雙黃補復合體組新生牙槽骨周圍可見陽性表達的成骨細胞數(shù)目明顯較多。
　　 結論:
　　 1.雙黃補在牙周組織工程中可有效控制牙周組織中炎癥反應，為牙周組織修復提供良好環(huán)境。
　　 2.雙黃補牙周組織工程中可刺激牙齦成纖維細胞向成骨細