UBXD2蛋白UBX結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能研究和核磁共振方法研究樹枝形分子與生物表面活性劑相互作用及基于樹枝形分子的藥物篩選.pdf

1、本論文的工作重點(diǎn)包括兩部分的內(nèi)容：第一部分是人的UBXD2蛋白UBX結(jié)構(gòu)域的克隆，表達(dá)和純化，并用液體核磁共振的方法解析了UBXD2 UBX結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)，并初步研究了UBXD2蛋白質(zhì)和VCP蛋白質(zhì)的相互作用。在結(jié)構(gòu)解析過程中，我們發(fā)現(xiàn)了UBXD2 UBX結(jié)構(gòu)域上位于與VCP VCP-N結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用的關(guān)鍵區(qū)域的一個脯氨酸處于順式構(gòu)象。第二部分是核磁共振方法研究樹枝形分子與具有生物活性的表面活性劑的相互作用和基于樹枝形分子的藥物篩

2、選。
　　 第一章是關(guān)于人的UBXD2蛋白質(zhì)的UBX結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能的研究。這一章的第一部分是對UBXD2蛋白質(zhì)以及UBX結(jié)構(gòu)域的研究進(jìn)展的一個綜述。UBXD2蛋白質(zhì)，又名erasin，最初是被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)降解(ERAD)過程有關(guān)的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，UBXD2蛋白質(zhì)是通過自身含有的UBX結(jié)構(gòu)域和VCP蛋白質(zhì)N端結(jié)構(gòu)域VCP-N發(fā)生相互作用參與這個過程。UBXD2蛋白質(zhì)因包含UBX結(jié)構(gòu)域而得名，而且UBX結(jié)構(gòu)域是UBX

3、D2上唯一的一個結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，UBX結(jié)構(gòu)域上含有高度保守的R…FPR的折疊花樣。這個折疊花樣是結(jié)合的關(guān)鍵部位，也是UBX結(jié)構(gòu)域和泛素蛋白質(zhì)或者含有泛素結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)構(gòu)上最大不同的地方。這一章第二部分和第三部分，我們克隆、表達(dá)了UBXD2 UBX結(jié)構(gòu)域，并利用傳統(tǒng)的核磁共振實(shí)驗(yàn)方法測定并解析了它的溶液結(jié)構(gòu)。根據(jù)解析獲得的結(jié)構(gòu)，UBXD2 UBX結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)由2段α螺旋和4段β折疊組成，并且有一段和發(fā)揮功能密切相關(guān)的loop區(qū)。2段α

4、螺旋和4段β折疊之間的疏水殘基形成了一個疏水核心來維持和穩(wěn)定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。通過同源序列比對發(fā)現(xiàn)，與發(fā)揮功能密切相關(guān)的loop區(qū)是保守的，而且里面有一個FP motif對結(jié)合至關(guān)重要。在解析的過程中，我們意外地發(fā)現(xiàn)UBXD2 UBX結(jié)構(gòu)域含有的6個脯氨酸中，有兩個處于順式構(gòu)象。其中一個正好位于結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)FP motif。通過用化學(xué)位移干擾實(shí)驗(yàn)，我們測定了UBXD2 UBX結(jié)構(gòu)域和VCP VCP-N結(jié)構(gòu)域的相互作用，并初步驗(yàn)證了這兩者的

5、相互作用比較弱，屬于一種常見的快交換。鑒于UBX結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)是一類三級結(jié)構(gòu)比較保守的蛋白質(zhì)，我們借用生物信息學(xué)手段，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已有的UBX結(jié)構(gòu)域p47 UBX和VCPVCP-ND1蛋白的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)，用計算機(jī)的方法模擬了UBXD2 UBX結(jié)構(gòu)域和VCPVCP-N結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，為解釋體內(nèi)UBXD2蛋白和VCP蛋白相互作用引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)降解提供結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 第二章的工作是使用核磁共振方法研究樹枝形分子與

6、具有生物活性的表面活性劑分子的相互作用和基于樹枝形分子的藥物篩選。這一章的第一部分，首先，我們對常用于化學(xué)生物學(xué)相關(guān)的核磁共振方法包括一維核磁共振譜、二維核磁共振譜，擴(kuò)散譜等等做了一個介紹，分別描述了各種不同的核磁共振方法的原理和應(yīng)用，可以深入研究和表征功能高分子和化學(xué)小分子之間的相互作用細(xì)節(jié)，可以提供結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合強(qiáng)度、結(jié)合作用力的類型和結(jié)合之后的空間定位或取向等等非常有用的信息。然后，我們對樹枝形分子(dendrimer)這種功能化

7、的高分子材料做了簡單介紹，包括樹枝形分子的歷史、合成，物理化學(xué)性質(zhì)以及應(yīng)用等等。接著，我們介紹基于樹枝形分子和化合物小分子相互作用的主—客體系統(tǒng)研究的內(nèi)容，并且以膽酸為代表介紹了樹枝形分子和具有生物活性的表面活性劑的相互作用研究是主—客體系統(tǒng)研究中的非常重要的一部分。研究樹枝形分子—膽酸的聚集體的結(jié)構(gòu)特性和相互作用對于了解樹枝形分子在生理體內(nèi)的代謝有很重要的意義，同時為開發(fā)樹枝形分子的臨床應(yīng)用研究做好鋪墊。最后我們介紹了藥物篩選和高通量

8、藥物篩選的內(nèi)容，并介紹了基于樹枝形分子相互作用的高通量藥物篩選的內(nèi)容和意義。這一章的第二和第三部分，我們用核磁共振研究了樹枝形分子和具有生物活性的表面活性劑脫氧膽酸的相互作用形成樹枝形分子和脫氧膽酸復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)脫氧膽酸分子只定位在樹枝形分子的疏水口袋而不結(jié)合在表面，從而說明了樹枝形分子和脫氧膽酸的結(jié)合是因?yàn)樗鼈冎g的疏水相互作用和氫鍵相互作用。通過2D-NOESY譜，我們得到了脫氧膽酸分子在樹枝形分子內(nèi)部疏水空腔中的定位信息。通過對比樹

9、枝形分子和膽酸類似分子CHAPS的相互作用研究結(jié)果，我們還發(fā)現(xiàn)了樹枝形分子對脫氧膽酸分子的包裹是一個跟客體分子尺寸有關(guān)過程。隨后，在研究樹枝形分子和脫氧膽酸、CHAPS的相互作用基礎(chǔ)上，我們利用常規(guī)的和新的核磁共振技術(shù)研究基于樹枝形分子結(jié)合的藥物的篩選，并設(shè)計了不同的方案應(yīng)對樹枝形分子—不溶藥物和樹枝形分子—可溶藥物兩種體系的高通量篩選并進(jìn)行了嘗試，提出一套基于樹枝形分子相互作用的高通量藥物篩選的核磁共振方法。基于Hadamard的快速

10、實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步減小核磁共振實(shí)驗(yàn)時間，提高高通量篩選的效率。Hadamard快速實(shí)驗(yàn)可以在提供相同的實(shí)驗(yàn)信息的基礎(chǔ)上可以把核磁共振的實(shí)驗(yàn)時間從整天減小到幾分鐘。這一點(diǎn)是高通量篩選所必需的。同時，由于Hadamard快速實(shí)驗(yàn)需要的時間很短，因此我們可以適當(dāng)?shù)匮娱L實(shí)驗(yàn)時間獲得更高的信噪比。這一套方法對于大規(guī)模地發(fā)現(xiàn)和篩選各種和樹枝形分子相互作用的化合物小分子具有重要的意義。同時，這種高通量篩選的方法還可以設(shè)計和優(yōu)化基于樹枝形分子相互作用藥物分