膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)在血竭顏面部鎮(zhèn)痛分子機(jī)制研究中的應(yīng)用.pdf

1、對(duì)中藥和天然藥物進(jìn)行有效成分研究和提取是中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中中藥藥理學(xué)研究的關(guān)鍵性問題，也是揭示中醫(yī)藥的科學(xué)本質(zhì)、開發(fā)創(chuàng)新藥物的重要途徑之一。 血竭是我國(guó)的傳統(tǒng)名貴中藥之一，在防治心血管疾病、治療風(fēng)濕疼痛癥、抗癌等方面開發(fā)利用潛力大。然而目前對(duì)血竭藥理作用機(jī)理的研究大多集中在其活血化瘀方面，為數(shù)不多的血竭鎮(zhèn)痛作用機(jī)理的研究也僅與其抗菌消炎止痛有關(guān)。但血竭能緩解神經(jīng)性痛的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象提示我們血竭的鎮(zhèn)痛作用機(jī)理可能還與其直接干預(yù)了痛覺信息的

2、傳入有關(guān)。由于血竭是一種中藥，化學(xué)成分復(fù)雜，從分子水平來解釋它的這種效應(yīng)，理應(yīng)闡明其藥效物質(zhì)。為此，鑒于三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜上的電壓門控性鈉通道在頭面部疼痛發(fā)生機(jī)制中的重要作用，我們對(duì)血竭進(jìn)行有效成分、有效部位(群)快速定量確定和在分子水平上分析其藥理機(jī)制的系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬研究，在系統(tǒng)分析研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，提出有效成分定量化的確切定義及中藥有效成分研究的方法學(xué)，確定血竭干預(yù)頭面部痛覺信息中樞傳入的藥效物質(zhì)，并將此研究作為中藥現(xiàn)代化中有

3、效成分確定和藥理機(jī)制深入分析的一個(gè)例證。 本文首先應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察了血竭對(duì)小鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞河豚毒素敏感型和河豚毒素不敏感型兩類電壓門控性鈉通道電流的影響。結(jié)果，血竭對(duì)兩種鈉通道電流均有濃度依賴性的抑制作用，0.1％的血竭影響兩類鈉通道的激活和失活過程，并使TTX-R鈉電流I-V曲線峰值向右偏移，延緩其復(fù)活過程。表明血竭除抗炎鎮(zhèn)痛外，還通過調(diào)制TG細(xì)胞電壓門控性鈉通道，干預(yù)頭面部痛覺信息的中樞傳入產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

4、為確定血竭產(chǎn)生上述鎮(zhèn)痛效應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，采用化學(xué)方法將最有可能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)的血竭黃酮部位提取分離，并應(yīng)用膜片鉗技術(shù)觀察了血竭黃酮部位對(duì)小鼠TG細(xì)胞兩類鈉通道電流的影響，用Hodgkin-Huxley模型擬合血竭黃酮部位作用前后的河豚毒素敏感型鈉通道電流，進(jìn)行參數(shù)估計(jì)。結(jié)果，0.1％血竭黃酮部位對(duì)兩類電壓門控性鈉通道電流均有濃度依賴地抑制作用，并影響鈉通道電流的失活和復(fù)活過程，而對(duì)其激活過程無明顯影響，表明上述抑制作用發(fā)生在鈉通道的失活

5、態(tài)和復(fù)活態(tài)。 采用化學(xué)方法進(jìn)一步從血竭黃酮部位中提取分離五種化學(xué)單體成分：龍血素B、劍葉龍血素A、劍葉龍血素B、紫檀芪和黃烷，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察了幾種主要單體化學(xué)成分對(duì)小鼠TG細(xì)胞兩類鈉通道電流的影響。結(jié)果，0.2mmol/L龍血素B對(duì)兩類電壓門控性鈉通道電流均有濃度依賴地抑制作用，并影響鈉通道電流的失活過程，而對(duì)其激活和復(fù)活過程無明顯影響，表明上述抑制作用發(fā)生在鈉通道的失活態(tài)而非激活態(tài)。而另一種單體成分劍葉龍血素B同樣能

6、可恢復(fù)性地抑制TG細(xì)胞鈉通道電流，只是抑制程度不及龍血素B；0.2mmol/L劍葉龍血素B影響鈉通道的激活和復(fù)活過程，而對(duì)失活過程無明顯影響，表明血竭總黃酮很可能是通過其所含的幾種單體成分分別作用于通道的不同動(dòng)力學(xué)階段而表現(xiàn)出對(duì)鈉電流的較強(qiáng)抑制作用的。 總結(jié)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立中藥藥效物質(zhì)的現(xiàn)代概念――有效成分的定量化定義和相應(yīng)的研究策略，并據(jù)此將血竭、血竭黃酮部位及其各單體化學(xué)成分的藥理效應(yīng)參數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)0.1％血竭黃酮部位

7、與0.1％血竭的藥理效應(yīng)參數(shù)有高度的一致性，從而確定血竭調(diào)制TG細(xì)胞鈉通道電流的有效部位為血竭黃酮部位；0.2mmol/L單體化學(xué)成分龍血素B、劍葉龍血素B與0.1％血竭的藥理效應(yīng)參數(shù)有較高的一致性，從而確定龍血素B是血竭調(diào)制TG細(xì)胞電壓門控性鈉通道電流，產(chǎn)生頭面部鎮(zhèn)痛效應(yīng)的主要有效成分，劍葉龍血素B為其輔助性成分。 本研究不僅有利于中藥血竭的進(jìn)一步推廣，更將為其二次開發(fā)和現(xiàn)代化應(yīng)用提供可靠的依據(jù)，并期能為現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究提供