應(yīng)用膜片鉗技術(shù)對(duì)人食管下括約肌L型鈣離子通道的研究.pdf

1、目的:1979年Liebermann-Meffer等學(xué)者通過對(duì)32例尸體食管胃連接部(esophagogastric junction,EGJ)標(biāo)本的解剖學(xué)研究,從而詳細(xì)闡述了食管胃連接部平滑肌束的大體排列方式,進(jìn)而提出了人類食管下括約肌(lower esophageal sphincter,LES)是由鉤狀纖維(clasp fiber)和套索纖維(sling fiber)共同構(gòu)成的這一理論。Liebermann-Meffert等學(xué)者認(rèn)

2、為這兩種纖維共同維持了LES的靜息高壓狀態(tài),從而形成了LES高壓帶(high-pressurezone,HPZ,15～30mmHg)。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步對(duì)LES的病理、藥理以及生理學(xué)特性奠定了解剖學(xué)基礎(chǔ)。隨后學(xué)者們對(duì)不同動(dòng)物的LES的功能調(diào)節(jié)機(jī)制和生理學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行了更為深入的研究。
　　 目前已被公認(rèn),平滑肌細(xì)胞胞漿游離Ca2+在平滑肌收縮過程中起著極為重要的“第二信使”作用。細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的變化是Ca2+跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)貯鈣

3、池(肌漿網(wǎng)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)攝取、釋放鈣等過程中動(dòng)態(tài)平衡改變的結(jié)果。平滑肌細(xì)胞的收縮活動(dòng)依賴于胞漿中Ca2+的濃度,低濃度的Ca2+引起平滑肌的舒張,高濃度的Ca2+引起平滑肌的收縮。引起平滑肌收縮的Ca2+主要來源于細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞外液的Ca2+。一般認(rèn)為,細(xì)胞外鈣跨膜進(jìn)入細(xì)胞是細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的觸發(fā)因素,細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加主要取決于細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放。細(xì)胞外液的Ca2+可通過細(xì)胞膜上的電壓依賴性鈣離子通道(voltage depen

4、dent calcium channel,VDCC)進(jìn)入細(xì)胞。電壓依賴性鈣通道可以分為L(zhǎng)型、T型、N型等亞型。在平滑肌細(xì)胞膜上主要有L型和T型兩種電壓門控式鈣通道。與L型鈣通道有所不同的是,T型鈣離子通道的密度與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān),正常情況下機(jī)體內(nèi)平滑肌細(xì)胞膜上的T型鈣離子通道只有很少量的表達(dá)。L型鈣通道具有細(xì)胞外鈣離子濃度依賴性,并且L型鈣通道的電流隨細(xì)胞外鈣濃度的增加而增加。鈣離子通道普遍存在于所有可興奮以及一些非可興奮細(xì)胞甚至原核生物細(xì)

5、胞膜上。與骨骼肌、心肌舒縮的機(jī)制相類似,L型鈣離子通道在平滑肌細(xì)胞的舒縮機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)平滑肌細(xì)胞膜去極化時(shí),通過L型鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Ca2+是平滑肌細(xì)胞收縮的主要觸發(fā)因素。
　　 1976年Neher和Sakmann建立了膜片鉗技術(shù)(patch clamp recordingtechnique),膜片鉗技術(shù)是一種以記錄通過離子通道的離子流來反映細(xì)胞膜上單一的或多數(shù)的離子通道分子活動(dòng)的技術(shù)。自從上世紀(jì)80年代開始應(yīng)用

6、于細(xì)胞膜離子通道研究以來,不僅為從分子水平了解細(xì)胞單離子通道的開放或關(guān)閉的動(dòng)力學(xué)、膜選擇通透和興奮性提供了直接手段,而且也為我們從離子通道水平闡明某些疾病的發(fā)生機(jī)制以及藥物作用機(jī)制提供了直接檢測(cè)手段。
　　 本研究應(yīng)用細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)人類LES平滑肌細(xì)胞膜上鈣離子通道的類型以及常見的影響因素進(jìn)行分析,并深入探討套索纖維和鉤狀纖維可能具有的不同生物學(xué)特征及其內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制。可以預(yù)見,對(duì)于LES的電生理研究將有助于對(duì)賁門失弛癥、食管下

7、括約肌高壓癥等食管運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病,以及胃食管返流病(gastroesophageal reflux disease GERD)等食管良性疾病病因的理解以及治療方法的改進(jìn)。
　　 方法:選取自2008年11月到2009年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院因食管中段癌行食管大部切除術(shù)的患者25例。其中,男性17例,女性8例,平均年齡54.2歲。從手術(shù)室采取新鮮手術(shù)標(biāo)本,銳性剝離賁門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層后,剪取套索纖維及鉤狀纖

8、維肌條,并把肌條剪成體積為2mm3小塊,用含膠原酶Ⅱ和木瓜酶的細(xì)胞分離液分離出單個(gè)平滑肌細(xì)胞。確認(rèn)細(xì)胞存活率在95％以上。然后保存于37℃Hepes緩沖液中備用。
　　 細(xì)胞存活率測(cè)定:用滴管吸取5滴細(xì)胞懸浮液,加入1滴0.2％的臺(tái)盼藍(lán)溶液,并于混勻后3分鐘以內(nèi)計(jì)數(shù),死亡的細(xì)胞將會(huì)被染成紅色,而活細(xì)胞仍能保持無色狀態(tài)。細(xì)胞存活率計(jì)算公式:存活率(％)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100％。
　　 將細(xì)胞灌流槽固定

9、在倒置顯微鏡的工作臺(tái)上,吸取數(shù)滴平滑肌細(xì)胞懸液滴于灌流槽中,靜置5分鐘,待細(xì)胞貼壁后,用與鈣電流相應(yīng)的灌流液灌流,沖洗掉死亡懸浮的細(xì)胞,選取附壁的、表面光滑整潔的、邊緣整齊的、靜止不動(dòng)的、立體感強(qiáng)的細(xì)胞作為研究對(duì)象。電極由硬質(zhì)玻璃毛坯經(jīng)水平拉制儀(Sutter P-97,USA)四步拉制而成,充以鈣離子電極內(nèi)液后阻抗為2～3MΩ。用三維液壓微操縱器移動(dòng)電極并貼近所選取的細(xì)胞進(jìn)行封接。封接成功后,通過抽吸所造成的負(fù)壓吸引使電極尖端內(nèi)的細(xì)胞

10、膜破裂,電極內(nèi)液和細(xì)胞內(nèi)液相通,從而在電極與細(xì)胞膜之間形成1GΩ以上的高阻抗封接,調(diào)節(jié)快補(bǔ)償以抵消電極夾持器與電極管壁的電容,再對(duì)電極施加負(fù)壓吸破細(xì)胞膜,見電容放電突然增大并伴有噪聲增大形成全細(xì)胞記錄模式,調(diào)節(jié)慢電容補(bǔ)償和串聯(lián)補(bǔ)償以減少瞬時(shí)充放電電流和鉗位誤差。
　　 脈沖信號(hào)由pulse+pulsefit軟件(HEKA,version8.53,法耳次,德國(guó))控制,通道信號(hào)用EPC-9膜片鉗信號(hào)放大器(HEKA,法耳次,德國(guó))放

11、大,通過Ag-AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導(dǎo)入細(xì)胞,產(chǎn)生的電流信號(hào)通過EPC-9轉(zhuǎn)換,被pulse+pulsefit軟件所收集、分析,收集到的數(shù)據(jù)采用Origin7.5擬合。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫(25℃)下進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,通過軟件SPSS14.0(SPSS公司,芝加哥,美國(guó))完成。以P＜0.05為差異認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。
　　 結(jié)果:
　　 1食管下

12、段括約肌細(xì)胞的形狀
　　 在倒置顯微鏡下觀察,新鮮分離的食管下括約肌套索纖維和鉤狀纖維平滑肌細(xì)胞均呈梭形,大小不一,長(zhǎng)短各異。在Hepes緩沖液中置于高倍鏡下觀察,部分細(xì)胞舒張,部分細(xì)胞處于不同程度的收縮狀態(tài)。套索纖維和鉤狀纖維平滑肌細(xì)胞均只有一個(gè)中心性核仁。套索纖維細(xì)胞平均長(zhǎng)度為99.8±25.4μm(53～15lμm,n=200);鉤狀纖維平滑肌細(xì)胞平均長(zhǎng)度為100.5±26.9μm(45～143μm,n=200)。兩者相比

13、較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.244,P=0.676)。
　　 2Ⅰ-Ⅴ曲線
　　 分別將選定細(xì)胞鉗制在-90mV和-60mV,并以10mV的階躍從-80mV到+30mV,時(shí)程200ms刺激細(xì)胞去極化。此時(shí)可記錄到—內(nèi)向電流,在約-50mV處反轉(zhuǎn)。兩次不同鉗制電壓的IV曲線均呈U型,不過峰值不同,在鉗制電壓為-90mV時(shí)的內(nèi)向電流-7.11±1.01pA/Pf(n=6)。鉗制電壓為-60mV時(shí)為-5.75±1.49pA/Pf(

14、n=6)顯著低于鉗制電壓為-90mV時(shí)的內(nèi)向電流-7.11±1.01pA/Pf(n=6)。兩者相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.142,P=0.041)。而且套索纖維平滑肌細(xì)胞與鉤狀纖維平滑肌細(xì)胞所記錄到的鈣電流未發(fā)現(xiàn)明顯不同。
　　 3乙酰膽堿對(duì)鈣離子內(nèi)向電流的影響
　　 乙酰膽堿可以明顯激活L型鈣離子通道,引起鈣電流峰值增大。加入1μmmol/L的乙酰膽堿后鉗制電壓為-60mV和-90mV的峰值分別為-9.21±0.94p

15、A/Pf(n=6)和-9.89±1.32pA/Pf(n=6)。正常電流峰值在鉗制電壓為-60mV和-90mV時(shí)分別為-5.75±1.49pA/Pf(n=6)和-7.11±1.01pA/Pf(n=6)。兩者相比較分別為(t=8.142,P=0.000)及(t=8.851,P=0.000)。在乙酰膽堿濃度為5μmmol/L和10μmmol/L時(shí)也具有相同趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:
　　 1鉤狀纖維細(xì)胞與套索纖維細(xì)胞的大小、形態(tài)基本