人食管下括約肌血管活性腸肽及其受體的表達(dá)研究.pdf

1、目的:正常人在非進食情況下,食管胃連接部是處于關(guān)閉狀態(tài),這樣可以保證食物由食管進入胃的單向流動,防止胃內(nèi)容物逆流入食管。食管下括約肌(LES)是位于食管胃連接部的環(huán)形肌肉,其寬度約2-3cm,在防治胃食管反流的機制中起重要作用。Liebermann-Meffert等首次提出,人LES由位于胃小彎側(cè)呈半環(huán)形的鉤狀纖維(clasp fibres)和位于大彎側(cè)呈斜行分布的套索纖維(sling fibres)共同構(gòu)成。這兩束肌纖維與膈腳一起在食

2、管胃結(jié)合部形成高壓帶,維持LES的關(guān)閉狀態(tài),使LES形成一種類似單向閥門的結(jié)構(gòu)。LES的收縮和舒張功能調(diào)節(jié)機制非常復(fù)雜,包括了神經(jīng)系統(tǒng)、體液因素及自身肌源性等多種因素。血管活性腸肽是一種由28個氨基酸組成的肽類物質(zhì),1902年由Said首次從豬小腸分離純化,因其明顯的擴血管作用而命名為血管活性腸肽(VIP)。后來研究發(fā)現(xiàn),其在循環(huán)、免疫、生殖、消化系統(tǒng)以及中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)中都有廣泛分布,所以被認(rèn)為是腦腸肽的一種。近年來越來越多的研究顯

3、示,VIP在正常及腫瘤細(xì)胞的調(diào)控方面起重要作用,VIP在人體各個部位與其受體結(jié)合后,通過一系列信號傳遞途徑發(fā)揮其生理作用。VIP受體廣泛分布于人和動物的多種組織器官上。根據(jù)受體的分布及受體與配體親和力的差異,將其分為兩大類:VIP1受體和VIP2受體。VIP1受體(VIPR1)主要分布于外周組織如肺、小腸、肝、脾、胰腺、主動脈,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布于中腦,而在其它腦區(qū)中分布極少。VIP2受體(VIPR2)的分布較VIP1受體更為廣泛

4、,幾乎在所有的組織中都有分布,如小腸、脾、胰島、腎、睪丸、卵巢等,但在肝臟和主動脈中沒有VIP2受體的表達(dá)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在VIP2受體,如海馬、垂體、松果體、腦干,因此有人認(rèn)為VIP2受體應(yīng)被稱為神經(jīng)內(nèi)分泌VIP受體。目前國內(nèi)外對人LES受體類型及其分型以及調(diào)節(jié)機制的研究,主要局限于膽堿能受體,對于VIP及其受體的研究則相對甚少。現(xiàn)有的對食管粘膜VIP及其受體的研究也主要是針對動物(貓、犬及負(fù)鼠等),與人有著種屬,生理學(xué)的差異,

5、對于人LES的VIP及其受體的表達(dá)規(guī)律及調(diào)節(jié)機制的相關(guān)研究則少之又少。本試驗采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)研究人LES內(nèi)的血管活性腸肽及其兩種受體亞型在套索纖維、鉤狀纖維、食管環(huán)行肌和胃底環(huán)行肌中mRNA的表達(dá)規(guī)律,為進一步研究VIP及其受體在人LES調(diào)節(jié)機制中的作用奠定基礎(chǔ),從而更為完善的闡述人LES調(diào)節(jié)機制,為食管運動功能障礙性疾病的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1選取2009年5月到2010年

6、1月在我院行手術(shù)治療高位食管中段癌患者,術(shù)中取食管胃連接部手術(shù)標(biāo)本共計30例,其中男性22例,女性8例。手術(shù)室采集新鮮標(biāo)本,銳性剝?nèi)ノ纲S門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層后,制備套索纖維(S)、鉤狀纖維(C)、食管體部環(huán)行肌(E)和胃底環(huán)行肌(G)的肌層組織,速凍于液氮容器中,轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存;
　　 2按照1ml Trizol/100mg組織的比例加入 Trizol,4℃條件下用組織勻漿器充分研磨組織,然后依次通過氯仿萃取

7、,異丙醇沉淀和75％乙醇的洗滌作用最終制備出組織RNA。DEPC水溶解,經(jīng)紫外分光光度計和1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度和完整性之后,組織RNA進入逆轉(zhuǎn)錄體系,得到cDNA。應(yīng)用VIP及其兩個亞型VIPR1及VIPR2的引物對cDNA行擴增處理,檢測其mRNA在4種肌層組織中的表達(dá),經(jīng)Gel Pro軟件分析擴增產(chǎn)物的光密度值(IOD),并計算VIP及其受體亞型與β-actin IOD的比值表示mRNA的相對含量。
　　 結(jié)果:

8、r>　　 1.RT-PCR.經(jīng)紫外分光度計測定,提取的總RNA A260/A280的值是1.8-2.0;1％瓊脂糖凝膠電泳顯示,28S帶的寬度及亮度約為18S帶的兩倍。
　　 2.VIP及其1型受體亞型mRNA在套索纖維、鉤狀纖維、食管平滑肌和胃底平滑肌各肌層均有表達(dá);內(nèi)參β-actin在250bp處亮度均勻,在各反應(yīng)中,擴增結(jié)果基本一致。擴增產(chǎn)物的長度與預(yù)計的基本一致,分別為199bp和394bp。VIPR2在各個部位未發(fā)現(xiàn)

9、表達(dá)。
　　 3.VIP在四個部位表達(dá)的數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布,用秩和檢驗,Chi-square=25.700,p=0.000,有統(tǒng)計學(xué)意義,因此VIP在C、S、E、G四個部位表達(dá)有差別。通過Nemenyi秩和檢驗兩兩比較得出VIP在S、E、G三個部位的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義,但是三個部位均與C部位對比有統(tǒng)計學(xué)意義。VIP在C部位平均秩次為86.93,在S部位為45.97,在E部位為59.83,在G部位為49.27?？梢奦IP在C部位的表達(dá)較

10、其他部位的表達(dá)量更高,在其余部位表達(dá)量無明顯差異。VIPR1在四個部位表達(dá)數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布,用秩和檢驗,Chi-square=1.540,p=0.673,無統(tǒng)計學(xué)意義,因此尚不能認(rèn)為VIPR1在C、S、E、G四個部位表達(dá)有差別。
　　 4.另外一種受體亞型VIPR2的mRNA在四種肌條中均未發(fā)現(xiàn)有表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.VIP及其1型受體亞型mRNA在套索纖維、鉤狀纖維、食管平滑肌和胃底平滑肌各肌層均有表達(dá)