放射配基分析法對(duì)人食管下括約肌M受體與配基親和力的研究.pdf

1、目的：食管下括約肌(LES)是食管胃連接部特殊增厚的肌束，由位于胃小彎側(cè)呈半環(huán)形的鉤狀纖維(clasp fibres)和位于大彎側(cè)呈斜行分布的套索纖維(sling fibres)共同構(gòu)成，這兩束肌纖維協(xié)同維持LES的關(guān)閉狀態(tài)，并在食管胃結(jié)合部形成LES高壓帶。人體LES起著單方向開(kāi)放的括約肌作用，正常狀態(tài)下，由于高壓帶的阻隔胃內(nèi)容物不能反流入食管，另一方面，由于LES高壓帶的適時(shí)降壓開(kāi)放允許了食物繼續(xù)下行入胃，或者嘔吐的發(fā)生和胃內(nèi)氣體的

2、排出。LES的收縮和舒張功能調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，包括了神經(jīng)、體液及自身肌源性等多種因素。乙酰膽堿是控制LES收縮的最主要神經(jīng)遞質(zhì)，它通過(guò)分布在平滑肌纖維上的毒蕈堿型受體(M受體)起調(diào)節(jié)作用。M受體廣泛存在于全身各平滑肌中，包括胃腸道，它在維持全身平滑肌收縮狀態(tài)時(shí)起主要作用。目前M受體家族移交明確的按藥理分型為M1、M2、M3、M4，或按分子生物學(xué)分型為m1、m2、m3、m4和m5五種亞型。其中主要分布在平滑肌纖維膜上的主要M受體亞型為M2

3、和M3，M2數(shù)量占75％-80％，但M3受體是主要功能類(lèi)型。本試驗(yàn)采用放射性配基受體結(jié)合分析法(Radio Ligand Binding Assay,RLBA)研究人食管下括約肌M受體與其配基的親和力，以進(jìn)一步探討M受體及其亞型在人LES調(diào)節(jié)機(jī)制中聽(tīng)發(fā)揮的作用。 方法：選取2007年5月至2007年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院因高位食管中段癌行食管大部切除術(shù)患者8例，采集未受侵的套索纖維和鉤狀纖維，制成約(2～4)mm×(8～1

4、2)mm的肌條，1)4℃條件下用組織勻漿器加入TBS液勻漿，勻漿液(4℃，1000×g)離心10分鐘。2)棄上清后，以美國(guó)PIERCE公司的膜蛋白提取試劑盒將沉淀運(yùn)用膜蛋白萃取法制備受體膜蛋白，反應(yīng)緩沖液稀釋?zhuān)捡R斯亮藍(lán)G-250定量，然后存于-80℃?zhèn)溆谩?)以3H-QNB為標(biāo)記配基，Atropine為拮抗劑，反應(yīng)體系總體積250 μl，使得3H-QNB與M受體充分結(jié)合，37℃恒溫孵育40min，進(jìn)行飽和試驗(yàn)。4)以Methoctra

5、mine和4-DAMP為M2和M3受體拮抗劑，以上述反應(yīng)體系重復(fù)前面的過(guò)程進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)。5)以49型玻璃纖維濾膜采用負(fù)壓抽濾的辦法分離結(jié)合和游離配基，將含有結(jié)合配基的受體的濾膜置于液體閃爍計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Graphpad Prism4.03軟件繪制濃度效應(yīng)曲線(xiàn)及競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)，并計(jì)算平衡解離常數(shù)Kd，最大結(jié)合量Bmax和半效抑制濃度IC50；用SPSS 13.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以P≤0.05有顯著性差異。 結(jié)果：

6、 1.飽和結(jié)合試驗(yàn)：分別得出M受體在套索纖維和鉤狀纖維的飽和曲線(xiàn)，并得出在LES的套索纖維上3H-QNB與M受體的最大結(jié)合量Bmaxs為568.2±5.28cpm，平衡解離常數(shù)Kds為1.049±0.054mmol/L，而在鉤狀纖維上二者的最大結(jié)合量Bmaxc為557.9±10.41cpm，Kdc為1.033±0.045mmol/L。M受體與3H-QNB的最大結(jié)合量在鉤狀纖維和套索纖維上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差意義(t=0.782，p=0.39

7、1)，平衡解離常數(shù)在鉤狀纖維和套索纖維上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差意義(t=0.395，p=0.540)。 2.競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)：得出M2受體和M3受體拮抗劑分別在套索纖維和鉤狀纖維的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)，同時(shí)在LES的套索纖維上Methoctramine的半量有效抑制濃度IC50Methoctramine為5.422±0.1 12× 10-6mol/L，4-DAMP的半量有效抑制濃度Ic504-DAMP為1.658±0.071 × 10-6mol/L，二者對(duì)3H

8、-QNB和M2、M3受體結(jié)合的抑制作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=6.26，p=0.025)，而在鉤狀纖維上Methoctramine的半量有效抑制濃度IC50Mdthoctramine為1.993±0.065 × 10～mol/L，4-DAMP的半量有效抑制濃度IC504-DAMP為5.680±0.105× 10-6mol/L，二者對(duì)3H-QNB和M2、M3受體結(jié)合的抑制作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=7.21，p=0.037)，且4-DAMP的抑制作用

9、強(qiáng)于Methoctramine。但是Methoctramine在鉤狀纖維和套索纖維上的抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.079，p=0.783)，4-DAMP在鉤狀纖維和套索纖維上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.024，P=0.878)。 結(jié)論： 1.3H-QNB與人LES平滑肌纖維膜上的M受體為特異性結(jié)合，M受體與3H-QNB的親和力套索纖維和鉤狀纖維上的分布無(wú)差別。 2.M3受體的拮抗劑4-DAMP對(duì)3H-QNB與人LES