內(nèi)皮素受體在人食管下括約肌的表達及調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、食管胃結(jié)合部(Esophageogastric junction，EGJ)一束約2-3cm寬、特殊增厚的環(huán)形肌肉被稱為食管下括約肌(Lower esophageal sphincter,LES)。Liebermann-Meffert在1979年第一次提出了人LES是由位于胃小彎側(cè)的鉤狀纖維(clasp fibres)與胃大彎側(cè)套索纖維（sling fibers）共同構(gòu)成。斜行的套索纖維，半環(huán)形的鉤狀纖維與膈腳一起，在包括神經(jīng)、體液等多種

2、因素的共同作用下保持持續(xù)的收縮狀態(tài)，因此EGJ形成了一個高壓帶，從而EGJ發(fā)揮了生理性抗返流屏障的作用，能夠有效地防止胃向食管的返流。
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的支配下，食管下括約肌收縮和舒張功能的調(diào)節(jié)由多種神經(jīng)遞質(zhì)、激素及自身肌源性因素共同完成。以往的研究發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)末梢與食管下括約肌的肌層腸道運動神經(jīng)元構(gòu)成了調(diào)節(jié)食管下括約肌收縮和舒張的神經(jīng)通路，即興奮性迷走神經(jīng)通路和抑制性迷走神經(jīng)通路。節(jié)前、節(jié)后膽堿能運動神經(jīng)元二者共同構(gòu)成了興奮

3、性運動傳導(dǎo)通路。而抑制性運動傳導(dǎo)通路則由節(jié)前膽堿能運動神經(jīng)元與節(jié)后非膽堿能非腎上腺素能神經(jīng)元(Nonadrenergic Noncholinergic，NANC)二者共同構(gòu)成。上述兩種神經(jīng)通路激活后引起膽堿能節(jié)后神經(jīng)元或者腸道神經(jīng)元各種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。通過這些神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而實現(xiàn)了神經(jīng)對食管下括約肌收縮、舒張的調(diào)節(jié)。根據(jù)既往科研結(jié)果，目前研究比較明確的是興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)通路激活后，神經(jīng)末梢主要釋放乙酰膽堿和P物質(zhì)兩種神經(jīng)遞質(zhì)，引起食管

4、下括約肌的收縮。而抑制性傳導(dǎo)通路激活后，導(dǎo)致腸道神經(jīng)元主要釋放一氧化氮和血管活性腸肽兩種神經(jīng)遞質(zhì)，使食管下括約肌舒張。同時還存在其他類型的神經(jīng)遞質(zhì)參與食管下括約肌的收縮與舒張過程，但目前看，他們并不發(fā)揮主要作用。
　　研究文獻發(fā)現(xiàn)，例如賁門失弛緩癥、胡桃夾食管和彌漫性食管痙攣等食管運動障礙性疾病，以及其它涉及食管排空及返流性疾病中，絕大部分表現(xiàn)有食管下括約肌舒張收縮功能異常。綜上所述，我們認為只有對食管下括約肌調(diào)節(jié)機制展開深入的研

5、究，才能開展對食管運動障礙性疾病有效的診斷與治療。目前國內(nèi)外關(guān)于人食管下括約肌的研究主要集中在P物質(zhì)、血管活性腸肽、乙酰膽堿、一氧化氮以及等神經(jīng)遞質(zhì)，信號傳導(dǎo)通路以及受體等方面。
　　內(nèi)皮素(Endothelin，ET)是一種由21個氨基酸組成的生物活性物質(zhì)。它主要由內(nèi)皮細胞合成，具有非常強烈的收縮血管的生物活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)除了具有強烈縮血管作用，同時內(nèi)皮素也具有誘導(dǎo)導(dǎo)血管生成、促分化、促細胞絲分裂和類細胞生長因子的性質(zhì)。研究

6、文獻發(fā)現(xiàn)人有3種內(nèi)皮素亞型(ET-1、ET-2、ET-3)，這三個異構(gòu)肽的生物活性有一定差異，ET-1的作用最強，ET-3最弱。內(nèi)皮素分子通過內(nèi)皮素受體(ETRs)發(fā)揮其生理和病理作用。內(nèi)皮素受體被發(fā)現(xiàn)廣泛地表達于動物的胃腸道之中。
　　本研究采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative PCR)測定各受體的表達相對定量，然后以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)驗證上述結(jié)果，在用蛋白印跡法(Western-blot)分析受體

7、蛋白表達是否與mRNA表達一致。然后以受體激動、拮抗及電場刺激(Electrical field stimulation，EFS)等方法對ETRs在人食管下括約肌中的表達及功能進行研究。探討了ETRs在人食管下括約肌調(diào)節(jié)機制中的作用，為進一步研究內(nèi)皮素及其受體在人食管下括約肌調(diào)節(jié)機制中的作用奠定基礎(chǔ)，從而進一步完善了人食管下括約肌的調(diào)節(jié)機制，為臨床治療食管運動功能障礙性疾病提供了理論依據(jù)。
　　第一部分、內(nèi)皮素受體在人食管下括約肌

8、的表達研究
　　目的:內(nèi)皮素受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，內(nèi)皮素通過內(nèi)皮素受體發(fā)揮生理和病理學(xué)功能。先以實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative PCR)測定各受體亞型在食管下括約肌的套索纖維、鉤狀纖維以及胃底和食管的環(huán)行肌中表達相對定量，然后以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)驗證上述結(jié)果，在用蛋白印跡法(Western-blot)分析受體蛋白表達是否與mRNA表達一致，探討內(nèi)皮素受體在人食管下括約肌中的表達規(guī)律。
　

9、　方法:選取2011年12月至2012年11月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科，罹患高位食管癌行食管大部切除術(shù)的患者32例。其中8名女性，24名男性，年齡平均61歲。手術(shù)室采集新鮮的手術(shù)食管胃結(jié)合部標本，實驗室以手術(shù)剪、鑷子銳性剝?nèi)グ彻芟露?、賁門和胃底的標本上所有的粘膜組織及粘膜下層，制備食管、套索纖維、鉤狀纖維和胃底環(huán)行肌的肌條。實驗提取組織內(nèi)的總RNA，以紫外線分光光度計鑒定其純度后，再以1％瓊脂糖凝膠電泳測定其完整性，之后，再分別

10、應(yīng)用2種內(nèi)皮素受體亞型的引物行實時定量PCR，測定這兩種受體的mRNA在4種肌條表達的△CT值，同時測定相應(yīng)部位組織內(nèi)β-actin△CT值，然后以二者計算受體亞型mRNA表達的相對定量。實時定量PCR后的擴增產(chǎn)物以5Xbuffer染色后電泳，驗證產(chǎn)物的分子量。再以最初提取的總RNA，分別應(yīng)用2種內(nèi)皮素受體亞型的引物行RT-PCR，驗證產(chǎn)物分子量。之后測定擴增產(chǎn)物的光密度值(IOD)，再用Gel Pro軟件分析，以內(nèi)皮素受體亞型的IOD

11、與β-actin的IOD的比值代表各個肌條中mRNA的相對表達量。提取各位點的組織總蛋白，以考馬斯亮藍G-250定量蛋白后，將各蛋白樣品調(diào)至濃度相同，再以電泳儀電泳分離出與內(nèi)皮素2個亞型相對應(yīng)的受體蛋白后再轉(zhuǎn)膜，分別以內(nèi)皮素受體2個亞型的抗體進行孵育，再以熒光二抗染色，經(jīng)Odyssey軟件分析熒光反應(yīng)條帶的光密度值(IOD)。
　　結(jié)果:紫外分光度計顯示總RNA A260/A280比值為1.8-2.0;1％瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA

12、完整性，可見28S處電泳條帶的寬度和亮度均是18S處條帶的約兩倍。實時定量PCR的內(nèi)參β-actin于130 bp處，在各個位點的擴增樣品中，內(nèi)參β-actin的實時定量PCR擴增結(jié)果一致。計算后發(fā)現(xiàn)2種內(nèi)皮素受體亞型的mRNA在各肌條中均有明確的表達，再將擴增的產(chǎn)物以5Xbuffer染色后電泳，驗證其分子量。于166 bp和128 bp可見兩條清晰的條帶，分別是內(nèi)皮素受體A(ETA)，內(nèi)皮素受體B(ETB)的mRNA。ETA受體亞型的

13、mRNA表達最高，在鉤狀纖維、套索纖維、食管平滑肌和胃底平滑肌肌條的表達水平分別為0.01151±0.00055;0.01207±0.00086;0.01185±0.00031;0.01161±0.00055;ETB表達水平比ETA低，依次為0.001691±0.00020;0.001793±0.00030;0.001616±0.00028;0.001571±0.00013;實時定量PCR擴增各個產(chǎn)物的長度與最初設(shè)計長度完全一致。同一肌

14、條中，不同的內(nèi)皮素受體亞型mRNA的表達水平比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=72.291;P=0.000)。同一個受體亞型在不同的位點，mRNA的表達并無差異(F=0.398; P=0.5329)。再以RT-PCR方法驗證上述結(jié)果，電泳后檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)參β-actin在各個位點的擴增結(jié)果基本一致，且與設(shè)計分子量一樣，同為362 bp。ETA和ETB這2種內(nèi)皮素受體的電泳條帶的分子量與設(shè)計大小一樣，分別為263 bp和200 bp。ETA相對表達量在鉤

15、狀纖維、套索纖維、食管平滑肌和胃底平滑肌肌條的表達水平分別為0.01163±0.00062;0.01219±0.00049;0.01147±0.00049;0.01148±0.00054; ETB表達水平比ETA低，依次為0.001725±0.00019;0.001700±0.00029;0.001632±0.00027;0.001625±0.00020;同一肌條中，不同的內(nèi)皮素受體亞型mRNA的表達水平比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=102.8

16、27;P=0.000)。同一個受體亞型在不同的位點，mRNA的表達并無差異(F=0.521;P=0.476)。在測定蛋白的表達實驗中發(fā)現(xiàn)2種內(nèi)皮素受體的亞型的蛋白在四種肌條內(nèi)均可見表達，ETA和ETB分子量大小分別為48.73kDa和50 kDa。ETA受體亞型的受體蛋白表達最高，在鉤狀纖維、套索纖維、食管平滑肌和胃底平滑肌肌條的表達水平分別為0.01121±0.00063;0.01145±0.00048;0.01035±0.00068

17、;0.01024±0.00099; ETB表達水平比ETA低，依次為0.001366±0.00022;0.001597±0.00027;0.001289±0.00020;0.001409±0.00021;同一肌條不同的內(nèi)皮素受體亞型的蛋白表達水平的比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=533.841;P=0.000)，其蛋白表達水平的強弱與mRNA表達水平的結(jié)果一致。同一內(nèi)皮素受體亞型的蛋白表達水平在不同的肌條間比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.398; P

18、=0.755)。
　　結(jié)論:人LES存在兩種內(nèi)皮素受體亞型，分別是ETA、ETB。ETA其表達水平高于ETB，可能在人LES的舒張、收縮功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著作用。
　　第二部分、內(nèi)皮素受體在人食管下括約肌調(diào)節(jié)機制中的功能
　　目的:研究非選擇性內(nèi)皮素受體激動劑和選擇性的內(nèi)皮素受體拮抗劑對人離體食管下括約肌肌條的套索纖維(sling)、鉤狀纖維(clasp)的作用，探討內(nèi)皮素受體在人食管下括約肌收縮和舒張的過程中所發(fā)揮的調(diào)節(jié)

19、機制。
　　方法:選取2012年10月到2013年12月在河北大學(xué)附屬醫(yī)院因高位食管癌行食管大部切除術(shù)患者30例。男性患者16例，女性患者14例，平均年齡65歲。手術(shù)室采集新鮮標本后剪下食管胃結(jié)合部（包含部分食管下端及部分胃底、胃小彎），以手術(shù)剪沿胃大彎切開標本全層后，沖洗干凈。，將標本粘膜面向上固定于蠟盤中（蠟盤盛Krebs液浸泡過標本表面，并以95％O2和5％CO2的混合氣體持續(xù)通氣）。銳性剝除掉食管下段以及胃賁門部的粘膜層及

20、粘膜下層，可見食管胃結(jié)合部的一束增厚、發(fā)白的環(huán)形肌肉即為食管下括約肌。肉眼識別出位于標本、胃小彎側(cè)的半環(huán)形的鉤狀纖維（clasp）與位于標本兩端、斜行走形、胃大彎側(cè)的套索纖維(sling)。分別沿鉤狀纖維(clasp)和套索纖維(sling)各自肌纖維走行的方向銳性游離肌束，制備用于實驗的(2～4) mm×(8～12) mm肌條。
　　將已經(jīng)用絲線分別扎緊兩端的肌條置于37℃恒溫、含Krebs液10ml的浴槽中，持續(xù)以5％CO2和

21、95％O2的混合氣體通氣。肌條上端固定于JZ101型肌肉張力換能器，下端固定，肌肉張力大小經(jīng)Medlab信號采集系統(tǒng)采集后記錄肌條的張力變化情況。輕柔、慢速地牽拉肌條，使之張力固定于400mg的穩(wěn)定狀態(tài)，將這時肌條保持的長度記錄為初始長度L0，接下來多次輕柔、慢速牽拉肌條，每次使其初始長度L0的增加幅度約25％左右，每次肌條在被動張力下穩(wěn)定15min后才可以再次牽拉。如此反復(fù)牽拉(間隔約20min)，直至肌條長度被牽拉至初始長度L0的2

22、00％，記錄肌條長度做為最適初長度。
　　肌條以最適初長度穩(wěn)定約40分鐘后，首先向浴槽中加入10-6 mol/L的卡巴膽堿(Carbachol)，待其產(chǎn)生的收縮力達到穩(wěn)定后采集張力變化數(shù)據(jù)，洗脫。待肌條恢復(fù)原狀態(tài)后，向浴槽的Krebs液中以濃度累積方式分別加入非選擇性內(nèi)皮素受體激動劑(Endothelin-1，ET-1)。給藥濃度為(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L)。觀察給藥后肌條張力變化情況，待肌

23、條的肌力穩(wěn)定后才可以繼續(xù)增加一個濃度，每次加藥與上一次加藥后濃度穩(wěn)定的時間間隔為5分鐘，測定數(shù)值后根據(jù)數(shù)據(jù)繪制累計給藥的濃度-反應(yīng)量效曲線。在觀察加入拮抗劑后的效應(yīng)階段，均于應(yīng)用激動劑前30min首先加入拮抗劑，拮抗劑的濃度與激動劑誘導(dǎo)肌條產(chǎn)生最大效應(yīng)的激動劑濃度相同。藥物誘發(fā)的肌條舒縮反應(yīng)，均以肌條舒縮產(chǎn)生的張力變化所占卡巴膽堿(Carbachol)于10-6 mol/L產(chǎn)生的收縮張力的百分比均數(shù)±標準誤（(x)±SE）來表示。

24、>　　結(jié)果:
　　1.非選擇性內(nèi)皮素受體激動劑ET-1在10-9mol/L的濃度就可以產(chǎn)生可以檢測到的人食管下括約肌鉤狀纖維(clasp)和套索纖維(sling)肌條的收縮效應(yīng)。在10-7mol/L時達到最大收縮張力，約為卡巴膽堿于10-6mol/L產(chǎn)生的收縮張力的58％。ET-1在鉤狀纖維(clasp)和套索纖維(sling)產(chǎn)生的效應(yīng)無顯著性區(qū)別(F=0.25 P=0.62)。
　　2.應(yīng)用受體阻滯劑后能拮抗激動劑的的收

25、縮效應(yīng)。(F=67.9 P=0.000)應(yīng)用選擇性的ETA阻滯劑BQ-123在（10-9、10-8、10-7、10-6mol/L）濃度下可以部分拮抗ET-1產(chǎn)生的肌肉收縮作用(F=31.3 P=0.0000)。選擇性的ETB阻滯劑BQ-788也可部分拮抗ET-1產(chǎn)生的肌肉收縮作用(F=5.6P=0.02511)，其拮抗作用與BQ-123相比較明顯較小(F=11.5 P=0.0021)。
　　結(jié)論:
　　1.非選擇性內(nèi)皮素受體

26、激動劑ET-1在10-9mol/L的濃度可以誘導(dǎo)人食管下括約肌肌條產(chǎn)生收縮效應(yīng)。隨著其濃度的升高逐漸達到最大收縮效應(yīng)應(yīng)。提示內(nèi)皮素受體A(ETA)、內(nèi)皮素受體B(ETB)可能參與了對人食管下括約肌收縮作用的調(diào)節(jié)。
　　2.選擇性的ETA阻滯劑BQ-123和選擇性的ETB阻滯劑BQ-788均可以部分阻斷非選擇性內(nèi)皮素受體激動劑ET-1對離體食管下括約肌肌條的收縮作用。進一步說明內(nèi)皮素受體A(ETA)、內(nèi)皮素受體B(ETB)不僅參與了

27、對人食管下括約肌的調(diào)節(jié)，而且ETA和ETB激動后在人食管下括約肌均表現(xiàn)為收縮效應(yīng)。另外ETA參與收縮效應(yīng)的比重要大于ETB。
　　第三部分、內(nèi)皮素受體在電刺激誘導(dǎo)人食管下括約肌反應(yīng)中的作用
　　目的:研究選擇性內(nèi)皮素受體的拮抗劑在電場刺激(EFS)下對人食管下括約肌的套索纖維、鉤狀纖維的作用，探討內(nèi)皮素受體在人食管下括約肌收縮調(diào)節(jié)機制中發(fā)揮的作用。
　　方法:選取2012年10至2013年12月在河北大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科

28、因高位食管中段癌，而手術(shù)食管大部切除術(shù)患者30例，其中男性患者21例，女性患者9例，平均年齡61歲。制備套索纖維和鉤狀纖維肌條，方法同前。將肌條置于保持37℃恒溫條件，含10 ml Krebs液的浴槽中。并向溶液中以95％O2和5％CO2的混合氣體持續(xù)通氣。將肌條的上端與肌肉張力換能器固定，以帶鉑金電極的L形的固定架上固定肌條的下端。適當(dāng)調(diào)整肌條位置，使之位于兩個平行的環(huán)形鉑金電極中間，肌條的上下端與電極環(huán)間的距離應(yīng)當(dāng)在3mm以上，將鉑

29、金電極連接于生理藥理多用儀行電場刺激(EFS)。肌條張力變化情況利用Medlab信號采集系統(tǒng)記錄。將肌肉牽拉至最適初長度方法同前（不同處為:使肌條張力固定于200mg的穩(wěn)定狀態(tài)，記錄初始長度L0）。肌條以最適初長度穩(wěn)定約60分鐘后，開始行EFS。
　　EFS刺激參數(shù):單脈沖方波、波寬5ms、電壓50V、頻率1～512Hz以倍數(shù)遞增。加入L-NNA后頻率從小到大行EFS，計算刺激后的最大效應(yīng)（Emax）。刺激停止后待肌條恢復(fù)平衡，先

30、向浴槽分別加入河豚毒素，在加藥20分鐘后在給予EFS，比較加藥前后刺激人LES出現(xiàn)的反應(yīng)有何變化。再分別加入選擇性內(nèi)皮素受體A拮抗劑BQ-123(10-6mol/L);選擇性的內(nèi)皮素受體B拮抗劑BQ-788（10-6mol/L）。在加藥后20min后再分別行EFS，比較加藥前后EFS刺激人食管下括約肌誘發(fā)的肌條反應(yīng)有無變化。EFS誘發(fā)的肌條反應(yīng)以肌條收縮或舒張的百分比的均數(shù)±標準誤（(x)±SE）來表示。
　　結(jié)果:
　　1

31、.EFS對人食管下括約肌（鉤狀纖維和套索纖維）的作用:
　　電場刺激可誘導(dǎo)鉤狀纖維和套索纖維出現(xiàn)頻率依賴性收縮，最大舒張時電刺激頻率為128Hz，EFS誘導(dǎo)食管下括約肌收縮的收縮的最大收縮百分比為19.3±0.8％。
　　2.人LES應(yīng)用河豚毒素后EFS誘導(dǎo)的頻率依賴性收縮能明顯降低，比較應(yīng)用前后，肌條的收縮效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)差異（F=23.3 P=0.000）。
　　3.人LES因EFS誘導(dǎo)產(chǎn)生的頻率依賴性收縮反應(yīng)，在應(yīng)用

32、選擇性內(nèi)皮素受體A拮抗劑BQ123(F=0.78 P=0.384661)和選擇性的內(nèi)皮素受體B拮抗劑BQ788(F=0.38 P=0.542583)前后收縮幅度均無明顯減低，差異無顯著性。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用河豚毒素后能顯著降低EFS引起的人LES頻率依賴性收縮。比較用藥前后肌條的收縮效應(yīng)發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異。提示EFS誘導(dǎo)產(chǎn)生的人LES頻率依賴性收縮是神經(jīng)來源的。
　　2.選擇性ETA拮抗劑BQ123和選擇性ETB