MicroRNA-1抑制內(nèi)皮素-1表達(dá)機(jī)制的初步研究.pdf

1、本研究通過(guò)對(duì)MicroRNA-1和ET-1mRNA時(shí)空表達(dá)譜檢測(cè)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)了MicroRNA-1可能參與調(diào)控ET-1基因表達(dá)的多項(xiàng)線索；利用報(bào)告基因、預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)序列缺失和突變等功能研究方法，證實(shí)了MicroRNA-1能夠通過(guò)ET-13'UTR上特定靶序列在轉(zhuǎn)錄后水平抑制內(nèi)源性ET-1基因表達(dá)。我們的研究首次發(fā)MicroRNA對(duì)心血管活性物質(zhì)的調(diào)控作用，為闡明MicroRNA在心血管生理活動(dòng)和疾病中的作用提供了新的依據(jù)。

2、 內(nèi)皮素(endothelin，ET)是1988年Yanagisawa等首先從豬的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離純化的一種由21個(gè)氨基酸組成的心血管活性多肽，主要分布于心血管系統(tǒng)，是目前已知最強(qiáng)烈的血管收縮物質(zhì)之一。在心臟，ET-1參與了心臟發(fā)育、心肌肥厚、心律失常等生理和病理生理過(guò)程。ET-1基因受不同水平的表達(dá)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控對(duì)于ET-1基因表達(dá)具有重要意義，ET-1 mRNA 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)存在多個(gè)富含AU的反應(yīng)元件(

3、A-U rich element，ARE)，直接影響mRNA的穩(wěn)定性；本課題組前期在大鼠急性缺血性心律失常模型中，采用針對(duì)ET-1 mRNA的反義寡核苷酸和ET-1 10-23脫氧核酶，均能有效下調(diào)ET-1基因表達(dá)，減少缺血性心律失常的發(fā)生，說(shuō)明內(nèi)源性調(diào)控機(jī)制和外源性干預(yù)手段均能夠在轉(zhuǎn)錄后水平影響ET-1基因表達(dá)。MicroRNA是近年來(lái)在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度在19-22核苷酸左右，其序列在物種間高度保守。Mi

4、croRNA通過(guò)與靶基因mRNA 3’非翻譯區(qū)(3'UTR)上相應(yīng)靶序列堿基之間不完全或完全的互補(bǔ)結(jié)合，而抑制mRNA的翻譯或?qū)е耺RNA的降解，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮對(duì)靶基因的沉默效應(yīng)。在生物體中已發(fā)現(xiàn)的microRNA序列多達(dá)600余種，參與了包括生物體發(fā)育、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及病原體感染等多種生理和病理生理過(guò)程。在心血管系統(tǒng)，已有報(bào)道MicroRNA參與了心臟發(fā)育、心肌肥厚和心律失常等多種生理和病理生理過(guò)程，尤其是一些心

5、臟組織特異性表達(dá)的MicroRNA與心臟特殊的生理結(jié)構(gòu)和病理過(guò)程密切相關(guān)。 在本研究中，我們擬通過(guò)檢測(cè)分析MicroRNA-1和ET-1 mRNA在組織細(xì)胞的表達(dá)分布以及在C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)變化及其相關(guān)性，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，尋找和明確MicroRNA-1參與ET-1基因表達(dá)調(diào)控的線索；利用報(bào)告基因系統(tǒng)和靶序列缺失突變等MicroRNA功能研究方法，確認(rèn)MicroRNA-1對(duì)內(nèi)源性ET-1基因表達(dá)的調(diào)控作用，并對(duì)這

6、種調(diào)控作用的機(jī)制進(jìn)行初步研究，為闡明MicroRNA在心臟發(fā)育、心肌肥厚和心律失常等心臟生理和病理生理過(guò)程中的功能作用提供新的理論依據(jù)，為心血管疾病防治的提供新的思路和治療策略。 材料和方法： (1)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：Hela和293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清(Biosource)和100U/ml青鏈霉素(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)10cm培養(yǎng)板底面積80％-90％，用0.25％-EDTA胰酶(Gibco

7、)消化細(xì)胞后，以每孔1×10<'5>個(gè)細(xì)胞接種細(xì)胞于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日用脂質(zhì)體 lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒載體。 (2) C2C12小鼠成肌細(xì)胞的培養(yǎng)和分化：C2C12培養(yǎng)于含10％胎牛血清和100U/ml青鏈霉素的DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)10cm培養(yǎng)板底面積 70％-80％，用0.25％-EDTA胰酶消化后，以每孔2×10<'5>個(gè)

8、細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日將生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換為含2％熱滅活馬血清的DMEM分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。分別收取分化第一、四、六天細(xì)胞樣品抽提 RNA，檢測(cè)分析MicroRNA-1和ET-1等基因mRNA表達(dá)變化。 (3)SYBR Green定量PCR檢測(cè)成熟MicroRNA和ET-1等基因mRNA的表達(dá)：以小鼠和人組織細(xì)胞總RNA為模板，分別利用MicroRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄(RT

9、)引物、隨機(jī)引物和OligodT20作為RT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到MicroRNA、U6剪接體RNA和ET-1等基因mRNA的cDNA模板；利用SYBR Premix Ex Taq酶(TakaRa)和特異性定量PCR引物對(duì)MicroRNA、U6和ET-1等基因mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析 (4)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)：利用TargetScan、BiBiserve等MicroRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站和軟件，對(duì)人ET-13’非翻譯區(qū)(3’UTR

10、)上MicroRNA-1作用的靶序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。 (5)載體構(gòu)建和報(bào)告基因檢測(cè)：以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA為模板利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增人ET-13'UTR不同區(qū)域片段，將其亞克隆至pGL3質(zhì)粒(Promega)熒光素酶報(bào)告基因下游，構(gòu)建表達(dá)融合ET-13'UTR的螢光素酶報(bào)告基因的pGL3重組載體；以Hela細(xì)胞基因組DNA為模板擴(kuò)增MicroRNA前體序列，將其亞克隆至pSuper質(zhì)粒H1 RNA啟動(dòng)子下游多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建表達(dá)

11、MicroRNA前體的pSuper重組質(zhì)粒。將上述兩種重組載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24小時(shí)后，用裂解液裂解細(xì)胞，采用雙螢光報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(promega)檢測(cè)樣品螢光素酶相對(duì)表達(dá)量。 (6)MicroRNA靶序列突變：以融合野生型ET-13’UTR的pGL3重組質(zhì)粒為模板，利用靶位點(diǎn)突變引物和高保真酶(TaKaRa)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到靶序列突變的線性化產(chǎn)物，DpNI限制性?xún)?nèi)切酶(Fermentas)消化PCR產(chǎn)物中的質(zhì)粒模板后

12、，在DH5α大腸桿菌中對(duì)線性化產(chǎn)物進(jìn)行同源重組，獲得靶序列突變的環(huán)化pGL3質(zhì)粒，通過(guò)測(cè)序證實(shí)靶序列的突變。 (7)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)：Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染MicroRNA表達(dá)載體24小時(shí)后，更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，利用人ET-1ELISA試劑盒(R＆D)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組上清液中ET-1蛋白的相對(duì)含量，以細(xì)胞總蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 結(jié)果： 小鼠和人部分組織細(xì)胞中Micr

13、oRNA-1和ET-1 mRNA表達(dá)分布和及其相關(guān)性：在小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、骨骼肌和胃腸平滑肌組織中，MicroRNA-1特異性高表達(dá)于心臟和骨骼肌組織，其他組織MicroRNA-1的相對(duì)表達(dá)水平很低；ET-1 mRNA主要表達(dá)于肺組織，腎臟、胃腸、大腦和心臟表達(dá)相對(duì)較低，骨骼肌和肝臟組織ET-1 mRNA表達(dá)量很低。在人心臟、骨骼組織以及Hela、293T和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，MicroRNA-1在心臟和骨骼肌中特

14、異性高表達(dá)，在其他三種細(xì)胞中表達(dá)量很低；ET-1 mRNA在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)量最高，在Hela細(xì)胞和心臟組織表達(dá)相對(duì)較低，在骨骼肌和293T細(xì)胞表達(dá)量很低。綜合上述結(jié)果： MicroRNA-1和ET-1 mRNA在組織細(xì)胞表達(dá)分布上存在一定負(fù)相關(guān)性，提示ET-1可能是MicroRNA的靶基因。 結(jié)論： 通過(guò)檢測(cè)分析 MicroRNA-1 和 ET-1 mRNA在小鼠和人部分組織細(xì)胞以及C2C12小鼠成肌細(xì)胞分化過(guò)程中空間表

15、達(dá)分布和時(shí)序表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)二者在表達(dá)分布和變化趨勢(shì)上存在負(fù)相關(guān)性，提示MicroRNA-1可能參與 ET-1基因表達(dá)調(diào)控；通過(guò)生物信息檢索，我們?cè)谌薊T-13’LITR上找到3個(gè)MicroRNA-1潛在作用靶序列；利用螢光報(bào)告基因系統(tǒng)我們發(fā)現(xiàn)MicroRNA-1能夠抑制融合人 ET-13’UTR的螢光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，表明MicroRNA-1對(duì) ET-13’UTR存在抑制性功能作用；結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果，我們利用MicroRNA-

16、1靶序列缺失和突變的方法，證明了MicroRNA-1對(duì)重組螢光素酶報(bào)告基因的抑制效應(yīng)由人 ET-1 3’UTR上第127-151位核苷酸處的MicroRNA-1靶序列所介導(dǎo)。最后，在Hela細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)了MicroRNA-1能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制內(nèi)源性ET-1基因的表達(dá)。我們的研究初步確認(rèn)MicroRNA-1對(duì)ET-1基因表達(dá)的抑制作用，證明了這種調(diào)控效應(yīng)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，明確了介導(dǎo)這一效應(yīng)的MicroRNA-1靶序列，從而進(jìn)一步拓展