microRNA-1抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖與遷移的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:microRNAs(miRNAs)是長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性RNA分子,通過(guò)結(jié)合靶mRNAs的3’UTR區(qū)來(lái)抑制基因的表達(dá)。最近研究表明,miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,然而有關(guān)miRNAs在葡萄膜黑色素瘤中的作用僅有少數(shù)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在研究microRNA-1(miR-1)在人眼葡萄膜黑色素瘤中的功能。
　　 方法:首先,通過(guò)real-time PCR技術(shù)檢測(cè)miR-1在葡萄膜黑色素細(xì)胞

2、D78以及兩株葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞M23與SP6.5中的表達(dá)情況。其次,用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-Aza-2’Deoxycytidine,5-Aza)和/或組蛋白脫乙?；敢种苿?Trichostatin A,TSA)兩種藥物處理M23和SP6.5后,用real-timePCR技術(shù)再檢測(cè)miR-1的表達(dá)水平。然后,通過(guò)Cy3標(biāo)記的NC序列轉(zhuǎn)染M23和SP6.5,確定基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在該類細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。并通過(guò)Northern blot檢

3、測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-1的表達(dá)情況。再通過(guò)MTS和Transwell法在細(xì)胞水平上分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-1后M23和SP6.5的增殖和遷移能力。最后,提取轉(zhuǎn)染miR-1后M23和SP6.5中的總蛋白,在分子水平上用Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,c-Met,以及其下游與細(xì)抱增殖遷移相關(guān)的重要信號(hào)分子FAK、ERK、AKT的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:通過(guò)real-time PCR技術(shù)檢測(cè)miR-1的表達(dá)情況,結(jié)果顯示miR-1

4、在D78中表達(dá)較高,而在M23與SP6.5中表達(dá)明顯降低(P<0.01)。經(jīng)5-Aza和/或TSA處理,M23和SP6.5中miR-1的表達(dá)水平與空白對(duì)照組(MOCK)相比明顯上調(diào)(P<0.01)。檢測(cè)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率,發(fā)現(xiàn)在M23和SP6.5中的轉(zhuǎn)染效率幾乎都達(dá)到了100％。通過(guò)Northern blot,結(jié)果顯示在M23和SP6.5中,只在轉(zhuǎn)染了miR-1的細(xì)胞中檢測(cè)到miR-1表達(dá)。通過(guò)MTS法檢測(cè)M23和SP6.5

5、的增殖能力,結(jié)果顯示,細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1后,其增殖能力與陰性對(duì)照組(Negtive Control,NC)比明顯下降(P<0.01)。通過(guò)Transwell法檢測(cè)M23和SP6.5的遷移能力,結(jié)果顯示,細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1后,其遷移能力與陰性對(duì)照組比明顯下降(P<0.01)。通過(guò)Western blot,結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組比,在M23和SP6.5中轉(zhuǎn)染miR-1后,c-Met、p-ERK1/2、p-FAK、CDK4、p-Rb、E2F2等