Micro RNA-135a抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖和遷移的研究.pdf

1、目的：
　　MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性、單鏈非編碼小RNA分子，長約22個核苷酸，通過與靶基因的3′端非編碼區(qū)（3′UTR）互補配對抑制靶基因的翻譯，或者直接降解靶基因的mRN A，其在個體發(fā)育、細胞分化、腫瘤形成等過程中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)， miRN A影響腫瘤細胞的增殖和遷移、周期等過程。葡萄膜黑色素瘤（UM）是一種起源于葡萄膜黑色素細胞的惡性腫瘤，是成年人眼部發(fā)病率最高的惡性腫瘤，目前尚不清楚其發(fā)生機

2、制。前期研究結(jié)果表明在葡萄膜黑色素瘤中 miR-135a表達顯著下調(diào)，本論文將進一步研究 miR-135a在葡萄膜黑色素瘤中的功能與分子調(diào)控機制，這將為臨床的診斷和治療提供新的思路。
　　方法：
　　在體外培養(yǎng)人眼葡萄膜黑色素瘤細胞M17和M21。
　　(1)采用real-time PCR技術(shù)檢測miRNA-135a在6例葡萄膜黑色素瘤組織樣本和正常對照中的表達情況。
　　(2)以陽離子脂質(zhì)體Lipo fecta

3、 mine為載體將 miR-135a轉(zhuǎn)染進葡萄膜黑色素瘤細胞M17、M21中，使miR-135a在M17、M21細胞中過表達。
　　(3)利用MTS方法檢測miR-135a對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖能力的影響。
　　(4)流式細胞技術(shù)檢測miRNA-135a對葡萄膜黑色素瘤細胞周期的影響。
　　(5) Transwell移行實驗檢測miR-135a對葡萄膜黑色素瘤細胞遷移的影響。
　　(6)Western blot

4、檢測轉(zhuǎn)染miR-135a后細胞內(nèi)重要的信號通路蛋白表達水平的變化。
　　(7)用生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶報告基因?qū)嶒炶b定miR-135a的靶基因。
　　(8)利用 RNAi技術(shù)干擾靶基因的表達，檢測其對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖和遷移的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)Real-time PCR技術(shù)檢測結(jié)果表明miR-135a在葡萄膜黑色素瘤組織中表達顯著下調(diào)。
　　(2) MTS結(jié)果顯示miR-135a顯著抑制葡

5、萄膜黑色素瘤細胞M17和M21的增殖能力。
　　(3)細胞周期檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-135a使葡萄膜黑色素瘤細胞M17和M21阻滯在G1期。
　　(4) Transwell結(jié)果表明miR-135a顯著抑制葡萄膜黑色素瘤細胞的遷移。
　　(5)熒光素酶報告基因結(jié)果顯示在葡萄膜黑色素瘤中SIRT1是miR-135a作用的靶基因。
　　(6)Western blot結(jié)果顯示葡萄膜黑色素瘤細胞M17和M21在轉(zhuǎn)染miR-1

6、35a后，細胞內(nèi)重要信號通路中的蛋白表達量下調(diào)。
　　(7)熒光素酶報告基因結(jié)果顯示在葡萄膜黑色素瘤中SIRT1是miR-135a作用的靶基因。
　　(8)利用RNAi技術(shù)干擾靶基因SIRT1的表達后，MTS、Transwell檢測結(jié)果顯示：葡萄膜黑色素瘤細胞的增殖受到抑制，細胞的遷移受到顯著抑制。
　　結(jié)論：
　　以上實驗結(jié)果表明，miR-135a在葡萄膜黑色素瘤組織中表達下調(diào)，miR-135a能夠顯著抑制葡萄