Capn4干擾對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：黑色素瘤是惡性程度最高的惡性腫瘤之一，晚期黑色素瘤患者總生存期低，預(yù)后差。做為預(yù)后最差的皮膚惡性腫瘤，近年來(lái)，其在世界范圍內(nèi)的其發(fā)病率和死亡率均持續(xù)上升。眾所周知，在原發(fā)灶切除后，黑色素瘤有很高的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。且轉(zhuǎn)移性黑色素瘤對(duì)高劑量IFN-α2b、化療、放療、免疫治療以及新近發(fā)展起來(lái)的分子靶向治療等治療手段均表現(xiàn)出高抵抗性。對(duì)于那些沒(méi)有BRAF突變以及BRAF突變患者經(jīng)BRAF抑制劑治療后進(jìn)展的患者，幾乎沒(méi)有特別有效的治療手段

2、可以選擇。因此，深入研究黑色素瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制和尋找一種可能的治療手段顯得十分必要。目前，大量的研究結(jié)果支持鈣蛋白酶在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移中起作用。鈣蛋白酶是一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)鈣依賴(lài)性半胱氨酸蛋白酶家族，它包括無(wú)處不在的μ-鈣蛋白和m-蛋白。μ-鈣蛋白和 m-鈣蛋白均形成異二聚體，二聚體分別包括被鈣蛋白酶1（Capn1）基因和鈣蛋白酶2基因（ Capn2）編碼的80 kDa的催化亞單位和被Capn4基因（CAPNS1，鈣蛋白酶小亞基1）編碼的

3、28 kDa調(diào)節(jié)亞單位。在過(guò)去的幾十年中，大量研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶的活性與多種生理過(guò)程及病理過(guò)程有關(guān)。這些生理過(guò)程包括細(xì)胞支架的重建、細(xì)胞信號(hào)、凋亡和細(xì)胞生存；病理過(guò)程包括腫瘤細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲等過(guò)程。μ-鈣蛋白和m-鈣蛋白在骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤中異?；罨?。作為鈣蛋白酶亞單位之一的Capn4，其功能也包括了調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲等等。目前研究發(fā)現(xiàn)，Capn4與多種腫瘤的遷移、侵襲有關(guān)，如：下

4、調(diào)Capn4抑制了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移，降低了金屬蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白（vimentin）和N-鈣蛋白（N-cadherin）的水平。Capn4的過(guò)表達(dá)與肝癌、肝內(nèi)膽管癌（ICC）、腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)、鼻咽癌(NPC)、非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Capn4被認(rèn)為可能作為HCC、ICC、NPC的一種分子靶向治療手段。研究證實(shí)，多種通路在惡性腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中起調(diào)節(jié)作用，這些通路包括Wnt/β-c

5、atenin（β-catenin）信號(hào)通路、EMT和NF-κB(p65)通路等。廣泛存在的β-catenin信號(hào)通路被稱(chēng)為促進(jìn)腫瘤進(jìn)程的“致瘤”信號(hào)通路，它影響惡性腫瘤細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)和分化等細(xì)胞進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在多種腫瘤細(xì)胞中核內(nèi)是增高的。異常的Wnt/β-catenin信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤的發(fā)生中起重要作用。EMT是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中最重要的事件之一，EMT通過(guò)改變腫瘤周?chē)奈h(huán)境以利于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)

6、移。研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶在EMT中亦發(fā)揮作用。在EMT過(guò)程中，E-鈣蛋白（E-cadherin）被下調(diào)，N-鈣蛋白（N-cadherin）和vimentin被上調(diào)。NF-κB在不同腫瘤模型中表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的功能。它在黑色素瘤細(xì)胞中也表現(xiàn)出高活性。有研究報(bào)道，在黑色素瘤腫瘤的發(fā)生進(jìn)程中，NF-κB起調(diào)節(jié)作用。大量的研究證實(shí)，β-catenin信號(hào)通路、EMT通路和NF-κB（P65）信號(hào)通路之間存在“相互對(duì)話”，并且互相影響活性及功能。

7、如：體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌細(xì)胞中抑制β-catenin信號(hào)通路的活性，可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和EMT進(jìn)程。在結(jié)腸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中，β-catenin信號(hào)通路和NF-κB通路相互影響。體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除Capn4抑制細(xì)胞遷移、侵襲。下調(diào)Capn4抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲，且降低了vimentin和 N-cadherin的表達(dá)水平。通過(guò)分析GEO：GSE3189基因芯片，發(fā)現(xiàn)Capn4在黑色素瘤組織中高表達(dá)。目前Capn4在黑色素

8、瘤中的作用機(jī)制尚不明確，本研究以β-catenin及EMT為靶向切入點(diǎn)，研究Capn4在惡性黑色素瘤細(xì)胞中的作用及機(jī)制，旨在發(fā)掘黑色素瘤細(xì)胞可能的遷移及侵襲機(jī)制、提供一種新的惡性黑色素瘤的分子靶向治療奠定實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。
　　方法：⑴從重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集黑色素瘤組織120例，正常組織34例供免疫組化用。把黑色素瘤組織及正常組織用多聚甲醛固定，然后經(jīng)過(guò)不同濃度的酒精梯度脫水，再用二甲苯透明，然后用石蠟包埋。然后讓其自然冷卻

9、、凝固，然后切片。經(jīng)甲醛固定、脫水、烤片等處理。為了封閉抗原中的部分非特異性位點(diǎn)，我們?cè)诮M織切片上滴加山羊血清工作液，再在每張切片上加1滴第一抗體（一抗 Capn4）。經(jīng)相關(guān)處理后在每張組織切片上加1滴酶標(biāo)抗兔的第二抗體（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記），在室溫下孵育30min。經(jīng)孵育、洗滌后在組織切片上滴加 DAB工作液。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片的顯色情況，當(dāng)觀察到淡黃色時(shí)，就判斷為陽(yáng)性表達(dá)，隨即終止顯色。再經(jīng)沖洗、蘇木素染核、酒精梯度脫水等處

10、理。本部分實(shí)驗(yàn)均由兩名病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片以及記錄結(jié)果。組織切片中細(xì)胞核或細(xì)胞漿出現(xiàn)（棕）黃色顆粒即為Capn4目的蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。⑵將人黑色素瘤細(xì)胞株A375、SK-MEL-1、MV3、M14以及HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于相應(yīng)的培養(yǎng)基中。待細(xì)胞生長(zhǎng)到融合度約達(dá)80％時(shí)，用胰酶消化傳代，傳代后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。用細(xì)胞刮刮下貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到EP管中，棄去上清液，加入細(xì)胞裂解液。采用 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒來(lái)檢測(cè)所提取的蛋白樣品濃度，以

11、細(xì)胞蛋白抽提裂解液為空白對(duì)照。吸光度值測(cè)定波長(zhǎng)調(diào)整為562nm，依次測(cè)定各樣品的吸光度值，每份細(xì)胞標(biāo)本均測(cè)定3個(gè)測(cè)定值，取這三個(gè)反應(yīng)值的均值作為結(jié)果。聚丙稀酰胺凝膠電泳，以目的蛋白的大小為依據(jù)，切下所需的膠條。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、封閉等處理，將已稀釋好的Capn4一抗均勻滴于蠟板上，過(guò)夜后再加入二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP））孵育。再滴加適量ECL顯影液于蠟板上。放入凝膠成像儀中顯影。內(nèi)參蛋白的灰度值及目的蛋白的灰度

12、值均通過(guò)Quantity one軟件計(jì)算后得到。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量為：目的蛋白（Capn4）與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值之比。⑶根據(jù)目的基因Capn4設(shè)計(jì)3個(gè)靶點(diǎn)（shRNA1、shRNA2、shRNA3）做為實(shí)驗(yàn)組以及1個(gè)無(wú)干擾功能的靶點(diǎn)為做對(duì)照組（Control shRNA）。把單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列（寡聚T核苷序列），連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體。測(cè)序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行高純度質(zhì)粒抽提。將黑色素瘤細(xì)胞株A3

13、75培養(yǎng)于DMEM+10%FBS的培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)80%左右時(shí)，加入胰酶消化傳代，傳代后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。將黑色素瘤細(xì)胞株A375分成四組實(shí)驗(yàn)：1組為對(duì)照組（con，Control shRNA），3組為實(shí)驗(yàn)組（shRNA1、shRNA2、shRNA3）。將構(gòu)建的Capn4干擾載體分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染成功后提取蛋白，“蛋白提取、電泳及灰度分析”步驟同“1.2 WB檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞及HaCaT細(xì)胞中Capn

14、4的表達(dá)”中的步驟。取每份細(xì)胞株3次試驗(yàn)的平均值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。⑷實(shí)驗(yàn)將A375/M14兩種細(xì)胞分別分成兩組：對(duì)照組 con(Control shRNA)及實(shí)驗(yàn)組shRNA（shRNA1）。將A375細(xì)胞株及M14細(xì)胞株培養(yǎng)于相應(yīng)的培養(yǎng)基中。取1.5×105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375/M14細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)，當(dāng)融合率達(dá)到60%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物添加到細(xì)胞中、轉(zhuǎn)染。用WB法檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞的

15、Capn4的表達(dá)?！耙豢?、二抗、蛋白提取、電泳及灰度分析”步驟同“1.2 WB檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞及HaCaT細(xì)胞中Capn4的表達(dá)”中的步驟。取每份細(xì)胞株3次試驗(yàn)的平均值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。⑸分別將A375細(xì)胞株、M14細(xì)胞株培養(yǎng)于相應(yīng)的培養(yǎng)基中。將前期構(gòu)建的Capn4干擾載體轉(zhuǎn)染到A375和M14細(xì)胞株中。含有干擾Capn4功能的 shRNA載體為 shRNA實(shí)驗(yàn)組，含有無(wú)干擾功能的 Control shRNA載體為con對(duì)照組，共4組細(xì)胞。

16、轉(zhuǎn)染方法同“2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染”。在96孔板的每孔鋪90μl含細(xì)胞的細(xì)胞懸液，即每孔含2.0×103 cells。每孔中各加10μl的5mg/ml的MTT液孵育，在第1d、2d、3d、4d、5d的時(shí)間點(diǎn)連續(xù)檢測(cè)。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上選擇450nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值，即450nm波長(zhǎng)測(cè)OD值（optical density，光密度），并記錄結(jié)果。取每份細(xì)胞標(biāo)本3次試驗(yàn)的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。SPSS軟件根據(jù)平均值畫(huà)出A375及M13細(xì)胞的生長(zhǎng)

17、曲線（以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線）。⑹細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法同前。將前期構(gòu)建的Capn4干擾載體轉(zhuǎn)染到A375和M14細(xì)胞株中。含有干擾Capn4功能的shRNA載體為shRNA實(shí)驗(yàn)組，含有無(wú)干擾功能的Control shRNA載體為con對(duì)照組。分別將A375/M14實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞配成1×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液；在鋪有載玻片的24孔板中按每孔2×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種，在孵箱中培養(yǎng)12h后用4%多聚甲醛固定等處

18、理，再將TUNEL染色液加入每孔中，避光條件下孵育1h。孵育結(jié)束的細(xì)胞一部分直接用于TUNEL熒光分析、一部分用于DAPI實(shí)驗(yàn)。將用于DAPI實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞用PBS浸洗3次后加入DAPI染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色，染色10 min后洗滌。將TUNEL染色及DAPI染色的細(xì)胞分別用抗熒光淬滅封片液封片，染后在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，觀察DAPI染色細(xì)胞的形態(tài)。⑺細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法同前。將前期構(gòu)建的Capn4干擾載體轉(zhuǎn)染到A375和

19、M14細(xì)胞株中。含有干擾Capn4功能的shRNA載體為shRNA實(shí)驗(yàn)組，含有無(wú)干擾功能的Control shRNA載體為con對(duì)照組。一抗為cleaved-caspase3，其余實(shí)驗(yàn)步驟，如：蛋白的提取、電泳、灰度分析等同前。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量為：目的蛋白（Claeved-Caspase-3）與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值之比。取每種細(xì)胞株3次試驗(yàn)的平均值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。⑻遷移實(shí)驗(yàn)：分別將A375細(xì)胞株、M14細(xì)胞株培養(yǎng)于相應(yīng)的培養(yǎng)基

20、中。將前期構(gòu)建的Capn4干擾載體轉(zhuǎn)染到 A375和M14細(xì)胞株中（shRNA實(shí)驗(yàn)組），含有無(wú)干擾功能Control shRNA載體的細(xì)胞為（con）對(duì)照組。取3×105 cells加入到Transwell小室中，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)48h-96h后將上室內(nèi)的培養(yǎng)基去掉，用棉棒將上室內(nèi)的細(xì)胞去掉，用結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色。染色后用顯微鏡拍照、計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：在“遷移實(shí)驗(yàn)”步驟的“將細(xì)胞加入Transwell小室”前，加做

21、步驟：“用1：8稀釋的Matrigel液包被Transwell小室底部膜的上室面，使其聚合成凝膠”，其余步驟與“遷移實(shí)驗(yàn)”相同。⑼A375細(xì)胞培養(yǎng)及Capn4干擾（shRNA轉(zhuǎn)染）方法同前。將出生滿(mǎn)五周的BALB/c雄裸鼠隨機(jī)分成2組（實(shí)驗(yàn)組：shRNA組；對(duì)照組：con組），每組3只。每只BALB/c裸鼠左側(cè)腹部皮下注射5×106個(gè)細(xì)胞。從第十天開(kāi)始檢測(cè)各組腫瘤體積，麻醉后游標(biāo)卡尺測(cè)腫瘤體積，腫瘤體積（單位：mm3）=長(zhǎng)×寬×寬/2。

22、每周記錄一次。觀察腫瘤體積。第四周后以頸椎脫臼致死法處死裸鼠取得腫瘤組織。⑽分別將A375細(xì)胞株、M14細(xì)胞株培養(yǎng)于相應(yīng)的培養(yǎng)基中。將前期構(gòu)建的Capn4干擾載體轉(zhuǎn)染到A375和M14細(xì)胞株中（shRNA轉(zhuǎn)染）實(shí)驗(yàn)組，含有無(wú)干擾功能Control shRNA載體的細(xì)胞為（con）對(duì)照組。一抗為Capn4、β-catenin-T（總蛋白）、β-catenin-N（核蛋白）、E-cadherin、N-cadherin、vimentin，以G

23、APDH為內(nèi)參、CDK4為β-catenin-N核內(nèi)參。其余實(shí)驗(yàn)步驟，如：蛋白的提取、電泳、灰度分析等同前。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量為：目的蛋白（ Capn4、β-catenin-T、E-cadherin、N-cadherin、vimentin）分別與內(nèi)參蛋白（ GAPDH）灰度值之比；β-catenin-N與核內(nèi)參蛋白（CDK4）灰度值之比，取每種細(xì)胞株3次試驗(yàn)的平均值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（采用t檢驗(yàn)，均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。P<0.05：差異有統(tǒng)

24、計(jì)學(xué)意義）。
　　結(jié)果：①黑色素瘤組織免疫組化染色計(jì)分方法：A：陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)分（0-3分）， B：組織中陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)分（0-3分）。M：黑色素瘤組織陽(yáng)性計(jì)分（0-9分）。計(jì)算式：分?jǐn)?shù)值（M）=A× B。M：0-4分為低表達(dá)，5-9分為高表達(dá)。黑色素瘤組織中Capn4高表達(dá)率約為66.67%(80/120)，而正常組織標(biāo)本中Capn4高表達(dá)率約為20.59%(7/34)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。②WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A375、

25、M14、SK-MEL-1、MV3四種黑色素瘤細(xì)胞中Capn4的表達(dá)均高于正常細(xì)胞HaCaT中Capn4的表達(dá)。以Quantity one軟件分析灰度值，Capn4在各黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著高于在HaCaT細(xì)胞系中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。③采用WB法，以GAPDH為內(nèi)參，和對(duì)照組相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3三個(gè)靶點(diǎn)均起到較好的干擾Capn4的效果，具有顯著性差異（P﹤0.01）。其中shRNA1

26、靶點(diǎn)效果最好，用shRNA1靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。④采用WB法，以GAPDH為內(nèi)參，和對(duì)照組相比，shRNA1可以顯著降低M375/M14細(xì)胞中Capn4的表達(dá)（P﹤0.05）。以SPSS軟件分析Quantity one軟件所得的灰度值，Capn4在shRNA干擾的A375/M14細(xì)胞中的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05）。shRNA1靶點(diǎn)干擾效果好且穩(wěn)定，可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾靶點(diǎn)。⑤實(shí)驗(yàn)組的OD值低于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，shRN

27、A干擾的A375及M14細(xì)胞均表現(xiàn)出低活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。⑥干擾Capn4的A375/M14細(xì)胞的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比高于對(duì)照組（P﹤0.01）；Capn4干擾細(xì)胞中TUNEL片段多于對(duì)照組，DAPI染色提示shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中細(xì)胞膜形態(tài)的變化多于對(duì)照組，TUNEL及DAPI原位融合支持上述結(jié)果。⑦采用WB法，以GAPDH為內(nèi)參，Quantity one軟件分析灰度值。和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的灰度值高于對(duì)照組。S

28、PSS軟件分析灰度值結(jié)果，和對(duì)照組相比，shRNA轉(zhuǎn)染（干擾Capn4）可以顯著增加M375/M14細(xì)胞中cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)（P﹤0.01）。⑧Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在侵襲實(shí)驗(yàn)及遷移實(shí)驗(yàn)中，Capn4干擾（ShRNA-轉(zhuǎn)染）的A375/M14細(xì)胞，其侵襲及遷移數(shù)量均顯著低于對(duì)照組，每組細(xì)胞取3次實(shí)驗(yàn)的平均值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。⑨和對(duì)照組相比，注射Capn4干擾細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組B

29、ALB/c鼠，腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照組。取每組3只老鼠腫瘤體積的平均值，以t檢驗(yàn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。⑩采用WB法，以GAPDH為內(nèi)參，和對(duì)照組相比，Capn4干擾（shRNA組，即shRNA1轉(zhuǎn)染）可以顯著降低M375/M14細(xì)胞中Capn4的表達(dá)（P﹤0.05）。
　　結(jié)論：⑴Capn4在黑色素瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正常組織及HaCaT細(xì)胞，shRNA轉(zhuǎn)染的質(zhì)?？梢愿蓴_（下調(diào)）Capn4