人工合成基因重組肽rLj-RGD4對小鼠黑色素瘤B16細胞的抑制作用.pdf

1、分類號：——密級：——學校代碼：!Q!魚主學號至Q!三!!QQ!Q魚三連掌研耗大擎碩士學位論文⑨人工合成基因重組肽rLj—RGD4對小鼠黑色素瘤B16細胞的抑制作用作者姓名：學科、專業(yè)：研究方向：導師姓名：時春風細胞生物學海洋制藥王繼紅教授2016年4月J㈣燃必摘要rLjRGD4是一個人工合成基因重組肽。本課題組以前期研究的rLjRGD3為原型進行了缺失突變體的基因設計，并且通過在表達序列增加終止密碼子，以獲得無純化標簽的rLj—RGD

2、4肽表達。rLjRGD4的原型rLjRGD3是一個分子量為145kDa的RGD毒素蛋白，其來源于海洋生物七鰓鰻。rLjRGD3含有3個RGD序列，具有強效抗腫瘤功能。由于山一RGD3分子量較大，在未來的生物制藥中存在潛在的免疫原性風險，故本課題對其進行了蛋白縮短改造，設計出LjRGD4基因。本課題人工合成的LjRGD4基因構建于pET23b質粒載體，對獲得的帶有陽性重組質粒(pET23bRGD4)表達菌BL21進行了終濃度為lmM的IP

3、TG重組表達。經(jīng)對表達時間和表達溫度的條件摸索，最后確認rLjRGD4在30℃條件下誘導12h可溶性表達量最高。rLjRGD4為自身帶有5個組氨酸殘基，故對無純化標簽的rLjRGD4仍可采用鎳柱進行親和層析純化。rLjRGD4肽分子量為627kDa，含有4個RGD模體。純化蛋白經(jīng)N端測序，結果證實表達序列和理論推導序列一致。為了研究無純化標簽的rLjRGD4肽對腫瘤細胞的生物學功能，本課題采用小鼠黑色素瘤細胞B16作為研究模型進行實驗。

4、本課題針對腫瘤的增長和轉移的幾個關鍵性步驟，對rLjRGD4肽的功能進行了測定。細胞增殖實驗(MTT法)表明，rLjRGD4肽能夠劑量依賴性地抑制bFGF誘導的小鼠B16細胞的增殖，其作用的半抑制濃度(halfmaximalinhibitoryconcentrationIC50)為96pM。細胞黏附實驗結果表明，rLj—RGD4以劑量依賴方式抑制B16細胞對纖粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的黏附。Transwell法和細胞劃痕

5、實驗結果證實，山RGD4對堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactorbFGF)誘導的B16細胞遷移具有抑制作用，且呈劑量依賴方式。利用Transwell和人工基質膜Matrigel模仿體內(nèi)細胞外基質環(huán)境進行的細胞浸潤實驗結果顯示，rLjRGD4對堿性成纖維生長因子誘導的B16細胞浸潤具有抑制作用且呈劑量依賴方式：小劑量48M的rLjRGD4對B16細胞浸潤的抑制率為317％，中劑量96pM的LjRGD4對

6、B16細胞遷移的抑制率為723％，而高劑量144“M的LjRGD4對B16細胞遷移的抑制率達到100％。接下來，本課題對rLjRGD4肽能否引起B(yǎng)16細胞發(fā)生凋亡進行了測定。采用Hochest33258染色和TUNELFITC染色結果顯示，rLjRGD4能顯著呈劑量依賴方式誘導B16細胞發(fā)生凋亡，這表明了rLjRGD4抑制B16細胞增殖的基礎是凋亡而不是壞死；利用鬼筆環(huán)肽一HTC染色研究了rLjRGD4對B16細胞骨架的影響。細胞骨架實

7、驗結果表明，rLjRGD4蛋白能以劑量依賴方式破壞細胞骨架并抑制細胞偽足的形成。通過Westernblot法進一步研究rLjRGD4作用于B16黑色素瘤細胞的機制，結果表明其能使Caspase3酶原表達并裂解成17kDa亞單位的水平增加、使B16細胞的抗凋亡基因BcL2表達下調。綜上所述，rLjRGD4能夠抑制腫瘤增長與轉移的關鍵性步驟包括增殖、黏附、遷移、浸潤及細胞偽足的形成，并且能夠誘導B16細胞發(fā)生凋亡。由于其rLjRGD4是分子