阿維A酸對鼠B16黑色素瘤增殖抑制及誘導分化的實驗研究.pdf

1、目的：從細胞實驗和動物實驗兩個角度觀察阿維A酸(Acitretin)及其聯(lián)合抗癌藥物順鉑(DDP)對鼠B16黑色素瘤細胞增殖、分化的影響，初步研究阿維A酸治療惡性黑色素瘤的作用及其機制，探討其作用機制是否與阿維A酸影響survivin、Fas及VEGF的表達有關(guān)，從而為臨床誘導分化治療惡性黑色素瘤提供實驗基礎。 方法： 1.體外實驗： 1.1 體外培養(yǎng)惡性黑色素瘤細胞株B16，采用四甲基偶氮唑藍(tetrzoli

2、um-based colorimetric assay，MTT)比色法檢測不同濃度阿維A酸作用不同時間后對該細胞增殖的影響；光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變。 1.2采用MTT比色法檢測阿維A酸與抗癌藥物順鉑聯(lián)合應用對惡性黑色素瘤細胞株B16的增殖抑制作用，采用金氏公式分析相互作用指數(shù)(q)，評價聯(lián)合后的作用，如q＞0.85表示相加作用，q＜0.85為拮抗作用。 2體內(nèi)實驗： C57BL/6J小鼠50只，于右前肢腋下

3、皮下注射濃度為1×106個/ml的B16黑色素瘤細胞懸液0.2ml建立荷瘤小鼠模型。小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為陰性對照組，阿維A酸低劑量組，阿維A酸高劑量組，順鉑組及聯(lián)合治療組。于皮下接種瘤細胞第二天開始給藥，用藥共21天，每天觀察小鼠的狀態(tài)，每3天測量一次瘤體積，最后一次給藥24小時后將小鼠處死，剝瘤稱重，計算抑瘤率。將腫瘤組織沿最大面剖開，常規(guī)固定并進行HE染色及形態(tài)學觀察。免疫組化染色觀察藥物對survivin、Fas及

4、VEGF在瘤組織中表達的影響。運用統(tǒng)計軟件SPSS12.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果： 1體外實驗： 1.1 MTT比色法顯示：阿維A酸(0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L和100μmol/L)對B16細胞增殖均具有抑制作用。不同濃度阿維A酸處理細胞24-72h后，與對照組相比，各處理組OD值均有不同程度下降，差異具有極顯著性(P＜0.01)。且隨阿維A酸處理濃度的增大、作用時間的延長，OD

5、值逐漸下降，阿維A酸對B16細胞的增殖抑制率也逐漸增大。 1.2光鏡下觀察細胞形態(tài)結(jié)果顯示：陰性對照組細胞貼壁生長良好，細胞呈梭形，透明，折光性好，細胞生長活躍。而用藥組細胞皺縮，破裂，呈不規(guī)則形，有的細胞兩端出現(xiàn)細長的偽足，細胞胞漿中出現(xiàn)空泡，脫落細胞增多。 1.3 MTT比色法分析阿維A酸聯(lián)合順鉑對B16細胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示：金氏公式分析相互作用指數(shù)q值均大于0.85，即0.1、1.0、10、100μmol/

6、L的阿維A酸可增強順鉑對B16細胞的增殖抑制作用，且隨阿維A酸濃度的增大，其對順鉑的協(xié)同作用逐漸增強。 2.體內(nèi)實驗： 2.1 瘤體積-時間生長曲線：各治療組小鼠腫瘤生長速度始終低于對照組，阿維A酸高劑量組、順鉑組和聯(lián)合給藥組抑制作用尤為顯著。 2.2瘤重、瘤體積及抑瘤率：阿維A酸低、高劑量組、順鉑組和聯(lián)合給藥組的平均瘤重均低于陰性對照組，抑瘤率分別為：26.94％、42.74％、60.64％和74.14％，與對

7、照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。各治療組平均瘤體積和抑制率也明顯低于對照組，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)。 2.3 HE染色觀察瘤組織：對照組瘤組織邊界不清細胞密集排列，異型性明顯，而治療組瘤組織中心及邊緣可見不同程度的大片狀或灶性壞死。 2.4免疫組化結(jié)果顯示：各治療組的survivin，VEGF表達均低于對照組(P＜0.05)，F(xiàn)as的表達均高于對照組(P＜0.01)，表明各治療組能顯著抑制凋亡基因

8、survivin和VEGF的表達，上調(diào)促凋亡基因Fas的表達。且各治療組Survivin的表達與Fas的表達呈負相關(guān)(rs=-0.766，P＜0.01)，與VEGF的表達成正相關(guān)(rs=0.724，P＜0.01)。 結(jié)論： 1.阿維A酸對鼠B16惡性黑色素瘤細胞具有增殖抑制及誘導分化的作用，為臨床MM的治療和化學預防提供了新的思路和理論依據(jù)。 2.阿維A酸在一定濃度和時間范圍內(nèi)對B16細胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)量效相