阿維A酸聯(lián)合干擾素對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16作用的研究.pdf

1、目的：黑色素瘤（malignant malanoma，MM）是一種嚴(yán)重威脅人們生命的腫瘤，占皮膚惡性腫瘤的第三位，具有惡性程度高、侵襲力強(qiáng)的臨床特點(diǎn)。外科手術(shù)仍是治療黑色素瘤的首選方法，但是即使外科手術(shù)切除，預(yù)后仍較差。因此，尋求有效的藥物治療成為黑色素瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　 維甲酸類（retinoids）包括維生素A的天然及人工合成的衍生物，具有廣泛的生物活性。維甲酸對(duì)正常上皮的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用，臨床上已被用來治療

2、和預(yù)防許多皮膚病及皮膚腫瘤。最近研究表明，維甲酸對(duì)多種惡性腫瘤有誘導(dǎo)分化、抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡等的作用，干擾素具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，維甲酸和干擾素分別屬于外源性和內(nèi)源性的分化誘導(dǎo)劑，二者聯(lián)合應(yīng)用，可以提高腫瘤對(duì)誘導(dǎo)劑的敏感性，從而降低單藥劑量，減少毒副作用，也可提高治療效果。但在皮膚黑色素瘤方面的研究未見報(bào)道。
　　 維甲酸類是一種有效預(yù)防皮膚腫瘤的藥物，其抗皮膚黑色素瘤的機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨以小鼠黑色素瘤紀(jì)胞株B16為

3、研究對(duì)象，探討維甲酸、干擾素在不同濃度、不同作用時(shí)間對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞增殖抑制作用及形態(tài)分化的影響，篩選兩藥聯(lián)合應(yīng)用的最佳作用時(shí)間和劑量；探討兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)小鼠B16細(xì)胞表達(dá)PTEN的影響。為干擾素、維甲酸類藥物誘導(dǎo)皮膚腫瘤細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 將B16細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（含青霉素100U/ml，含鏈霉素100U/ml，

4、PH7.2）中，置于37℃、飽和濕度、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　 2 MTT比色分析法檢測(cè)阿維A和干擾素對(duì)小鼠B16細(xì)胞增殖抑制的影響。
　　 2.1不同濃度阿維A（0.1umol/L、1.0umol/L、10umol/L）分別作用24、48、72小時(shí)后對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響。
　　 2.2不同濃度干擾素（500u/ml、1000u/ml、2000u/ml）分別作用24、48、72小時(shí)后對(duì)B16細(xì)胞

5、增殖的影響。
　　 2.3聯(lián)合應(yīng)用1.0umol/L阿維A和1000u/ml干擾素作用48小時(shí)后對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響，采用金氏公式分析相互作用指數(shù)（q），評(píng)價(jià)聯(lián)合后的效應(yīng)。
　　 3倒置相差顯微鏡觀察各組藥物處理后對(duì)小鼠B16細(xì)胞的細(xì)胞分化及形態(tài)的影響
　　 4應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)s-p法檢測(cè)各組藥物處理后小鼠B16細(xì)胞PTEN蛋白的表達(dá)情況
　　 5采用流式細(xì)胞分析術(shù)，檢測(cè)小鼠B16細(xì)胞的細(xì)胞周期變化和凋

6、亡的發(fā)生
　　 將實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為陰性對(duì)照組（不加任何藥物）、阿維A組（1.0umol/L）、干擾素組（1000u/ml）、阿維A（1.0umol/L）聯(lián)合干擾素組（1000u/ml）。各組藥物干預(yù)48小時(shí)后，收集各組別細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期分布情況。
　　 6流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)各藥物處理后B16細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)情況。
　　 7運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用單因

7、素方差分析，以a=0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1 MTT比色分析法檢測(cè)處理因素對(duì)小鼠B16細(xì)胞增殖的影響（相對(duì)抑制率）
　　 1.1阿維A酸組各組間差別具有顯著性（p<0.05）。不同濃度的阿維A酸對(duì)小鼠B16細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系。
　　 1.2干擾素組各組間差別具有顯著性（p<0.05）。不同濃度的干擾素對(duì)小鼠B16細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依

8、賴效應(yīng)和時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系。
　　 1.3阿維A聯(lián)合干擾素組將實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為陰性對(duì)照組（不加任何藥物）、阿維A組（1.0umol/L）、干擾素組（1000u/ml）、阿維A（1.0umol/L）聯(lián)合干擾素組（1000u/ml）。阿維A酸和干擾素聯(lián)合應(yīng)用可抑制B16細(xì)胞增殖，與阿維A酸或干擾素單獨(dú)應(yīng)用比較，差異有顯著性（p<0.05）。金氏公式分析表明阿維A與干擾素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)B16細(xì)胞有協(xié)同的抑制作用。
　　 2阿維A

9、及干擾素對(duì)小鼠B16細(xì)胞分化及形態(tài)的影響
　　 陰性對(duì)照組細(xì)胞呈梭形或多角形，貼壁生長(zhǎng)，分布均勻，大小基本一致，增殖旺盛，核固縮現(xiàn)象偶見；阿維A作用細(xì)胞24小時(shí)后，B16細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)不佳，細(xì)胞皺縮、破裂，有的細(xì)胞兩端出現(xiàn)偽足，飄浮細(xì)胞增多等現(xiàn)象，隨著阿維A作用時(shí)間的延長(zhǎng)，上述現(xiàn)象更加明顯；干擾素細(xì)胞呈雙極性改變，B16細(xì)胞變狹長(zhǎng)，脫壁懸浮細(xì)胞增多，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，上述現(xiàn)象更加明顯；兩者聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞數(shù)目減少，脫壁

10、懸浮細(xì)胞明顯增多，雙極性細(xì)胞明顯可見。
　　 3免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)干擾素及阿維A誘導(dǎo)前后對(duì)小鼠B16細(xì)胞PTEN表達(dá)情況
　　 PTEN蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi)，DAB染色呈棕黃色。各組細(xì)胞PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)的程度不同，陰性對(duì)照組細(xì)胞PTEN表達(dá)較弱，呈淺棕黃色；在阿維A組，干擾素組及聯(lián)合用藥組B16細(xì)胞中，PTEN的染色程度均有不同程度的增強(qiáng)，差異具有顯著性（p<0.05）。
　　 4流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組藥物處理

11、后細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞周期變化
　　 各組藥物均能使G1期延滯，G1-S期轉(zhuǎn)化抑制，將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，使S期細(xì)胞的比率減少。阿維A與聯(lián)合干擾素應(yīng)用具有協(xié)同作用，但二者誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的作用并不顯著。
　　 5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組藥物處理后B16細(xì)胞PTEN蛋白的表達(dá)情況
　　 與陰性對(duì)照組相比，各藥物處理組作用48小時(shí)后，表達(dá)PTEN的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高，阿維A、干擾素和聯(lián)合用藥組作用B16細(xì)胞48小時(shí)后，P

12、TEN蛋白表達(dá)熒光指數(shù)（FI）分別為1.1233、1.2033和1.6300，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較差異也都具有顯著性（p<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.阿維A酸和干擾素都能抑制B16細(xì)胞的增殖，并且在一定的濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，二者對(duì)B16細(xì)胞增殖的抑制率具有量效相關(guān)性和時(shí)間依賴性。
　　 2.阿維A聯(lián)合干擾素對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制率優(yōu)于阿維A和干擾素單用，二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。
　　 3.阿維A酸