維生素E琥珀酸酯對(duì)黑色素瘤B16荷瘤小鼠抑瘤作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn),研究維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate,VES;α-tocopheryl succinate,α-TOS)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡的影響。通過相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,進(jìn)一步探討VES抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制,從而為黑色素瘤治療提供新的方法及相應(yīng)的理論依據(jù)。
　　 方法:將40只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組,每組8只。將鼠黑色素瘤B16細(xì)胞懸液接種于各組小鼠右側(cè)背部皮下,每只

2、1×106個(gè),建立小鼠黑色素瘤移植瘤模型。當(dāng)多數(shù)小鼠荷瘤后開始給藥,采用腹腔注射給藥方式:實(shí)驗(yàn)組分別給予VES12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg腹腔注射,每天一次,連續(xù)五天,休兩天,共兩周;對(duì)照組給予芝麻油0.05ml/只,給藥方法及時(shí)間同實(shí)驗(yàn)組;陽(yáng)性對(duì)照組給予達(dá)卡巴嗪(Dacarbazine,DTIC)0.2ml(80mg/kg)腹腔注射,每天一次,連續(xù)五天。兩周后,頸椎脫臼處死各組小鼠,剝瘤稱重,計(jì)算抑瘤率;顯微鏡觀

3、察VES作用后的瘤細(xì)胞大體形態(tài)變化,透射電鏡觀察VES作用后的瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組瘤細(xì)胞周期分布及凋亡率;免疫組化法檢測(cè)各組瘤細(xì)胞S-100,Survivin,Caspase-3的蛋白表達(dá)情況;運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1 VES可抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng):VES(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)各劑量組對(duì)小鼠B16移植瘤的抑制率分別為:13

4、.72％、31.22％、45.58％,呈劑量依賴性。達(dá)卡巴嗪組抑瘤率為55.64％,高于VES各組。各組小鼠處死前的體重比較:VES各處理組與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);陽(yáng)性對(duì)照組體重有較明顯下降,與陰性對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 2 VES可阻滯瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)分化和凋亡:流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示VES12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg劑量組的細(xì)胞,S期比例逐漸增加

5、,呈劑量相關(guān)性,與陰性對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。VES12.5mg/kg、25mg/kg劑量組瘤細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加,與陰性對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。VES各劑量組瘤細(xì)胞的凋亡率分別為:20.88±0.58％、22.71±0.55％、27.22±0.59％,陰性對(duì)照組為6.73±0.97％,均低于陽(yáng)性對(duì)照組凋亡率30.95±0.52％,VES各組與對(duì)照組

6、、陽(yáng)性對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 3 VES對(duì)瘤組織細(xì)胞形態(tài)的影響:
　　 3.1經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后,電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài):陰性對(duì)照組瘤組織邊界不清,細(xì)胞密集排列,異型性明顯,而VES治療組(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)瘤組織中心及邊緣可見不同程度的片狀或灶性壞死,黑色素顆粒釋出,散布于細(xì)胞間。
　　 3.2透射電鏡觀察:在未經(jīng)VES處理過的陰性對(duì)

7、照組移植瘤B16細(xì)胞中,胞膜完整,細(xì)胞核大,不規(guī)則形,核質(zhì)比大,常染色質(zhì)豐富,異染色質(zhì)較少,胞質(zhì)中細(xì)胞器少,未見典型的黑色素小體;然而,經(jīng)VES(12.5mg/kg、25mg/kg)作用后,細(xì)胞表面微絨毛減少,細(xì)胞核變小,核內(nèi)異染色質(zhì)增多,部分濃縮,核質(zhì)比變小,可見大量典型的黑色素小體;50mg/kgVES作用后,細(xì)胞出現(xiàn)不同程度凋亡改變;胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡,線粒體脊和膜部分或大部分融合消失,核膜局部向外呈泡狀突起,核染色質(zhì)高度濃縮,電子密

8、度增高,邊集于核膜下,形成新月體狀,即凋亡細(xì)胞的特征性形態(tài)改變,凋亡半月,但無(wú)凋亡小體。
　　 4免疫組化檢測(cè)瘤細(xì)胞S-100、Survivin、Caspase-3蛋白表達(dá):按照IHS值法進(jìn)行免疫組化評(píng)分。VES各組Survivin、S-100蛋白表達(dá)值(IHS值)隨VES濃度增大而降低,Ca spase-3蛋白表達(dá)值隨VES濃度增大而升高。三種蛋白各自比較,VES處理組和陰性對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.0

9、1)。且各治療組Survivin的表達(dá)與Caspase-3、的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(rs=-0.705,p＜0.01);與S-100的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.797,p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1 VES對(duì)鼠B16黑色素瘤移植瘤生長(zhǎng)有顯著的抑制作用,且呈一定的量效關(guān)系。
　　 2 VES有雙重作用,12.5mg/kg、25mg/kg VES可將細(xì)胞阻滯于G0/G1期,誘導(dǎo)部分惡性黑色素瘤細(xì)胞分化,透射電鏡觀察

10、可見大量典型的黑色素小體。50mg/kgVES可以阻滯B16細(xì)胞周期于S期,誘導(dǎo)凋亡,抑制腫瘤增殖。
　　 3 VES具有抑制黑色素瘤增殖,致S-100表達(dá)減低,降低其惡性程度的作用。其機(jī)制可能是一方面下調(diào)Survivin蛋白,調(diào)節(jié)瘤細(xì)胞分化;另一方面啟動(dòng)Caspase-3依賴的凋亡途徑。
　　 4 VES對(duì)鼠B16黑色素瘤移植瘤生長(zhǎng)有較顯著的抑制作用,低劑量誘導(dǎo)分化,高劑量誘導(dǎo)凋亡,為臨床惡性黑色素瘤的治療和化學(xué)藥物預(yù)