DHODH抑制引起黑色素瘤細(xì)胞周期阻滯、自噬.pdf

1、目的：惡性黑色素瘤(MM)是起源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。近年來，我國惡性黑色素瘤發(fā)病率迅速增長。多數(shù)早期患者能夠通過手術(shù)得到治愈，但對(duì)于中晚期患者，標(biāo)準(zhǔn)化療效果欠佳，因此探索高效低毒的新方法尤為重要。二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)存在于人類線粒體內(nèi)膜，是一種含鐵的黃素依賴酶，在嘧啶從頭合成途徑中起著關(guān)鍵的作用。DHODH抑制劑影響嘧啶合成，早在1959年就被證明可以抑制腫瘤。來氟米特(Leflunomide)是

2、一種5~甲基異惡唑~4~甲酰胺衍生物，是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床治療的 DHODH抑制劑。近年來，不論是在體外細(xì)胞培養(yǎng)還是動(dòng)物模型研究中，DHODH的失活或者下調(diào)可以明顯抑制腫瘤的增殖，尤其是在黑色素瘤。因此DHODH可能成為新的腫瘤治療靶點(diǎn)， leflunomide有望成為新型腫瘤靶向治療藥物。但來氟米特在黑色素瘤中的作用尚無報(bào)道，因此本研究通過觀察 leflunomide抑制 DHODH及干涉DHODH兩種方法對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞A375

3、和MV3增殖、周期、死亡的影響，探索抑制 DHODH對(duì)軟瓊脂克隆形成和荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制情況，進(jìn)一步探究抑制 DHODH引起腫瘤細(xì)胞增殖抑制、死亡的機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法、MTT（四甲基偶氮唑藍(lán)）比色法分析不同濃度的leflunomide（0μM、50μM、100μM、200μM）分別在24h、48h、72h、96h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞增殖抑制作用，同時(shí)應(yīng)用BrdU免疫熒光對(duì)leflu

4、nomide及干涉DHODH抑制A375和MV3細(xì)胞增殖情況進(jìn)行分析；
　　2.應(yīng)用PI單染流式細(xì)胞技術(shù)、Western Blot分析檢測(cè)leflunomide及干涉DHODH對(duì)細(xì)胞周期的影響；
　　3.通過AnnexinV~FITC/PI雙染流式細(xì)胞分析和Hoechst33342染色驗(yàn)證leflunomide是否能誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡；
　　4.采用Western Blot、免疫熒光和GFP~Lc3B瞬轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證le

5、flunomide是否誘導(dǎo)A375和MV3細(xì)胞發(fā)生自噬；
　　5.通過細(xì)胞周期分析及Western Blot分析補(bǔ)充外源性尿嘧啶或者過表達(dá)DHODH后是否可以挽救細(xì)胞周期阻滯及自噬；
　　6.軟瓊脂克隆形成分析和小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證leflunomide是否能抑制黑色素瘤細(xì)胞A375和MV3的成瘤能力。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT結(jié)果顯示leflunomide能抑制A375細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴

6、關(guān)系；BrdU免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)，與DMSO對(duì)照組相比，leflunomide處理組BrdU陽性細(xì)胞百分比顯著降低；
　　2.PI單染流式細(xì)胞分析顯示：與DMSO對(duì)照組相比，leflunomide處理組細(xì)胞周期S期比例顯著增加，而G0/G1期比例相應(yīng)減少，通過Western Blot發(fā)現(xiàn)處理組周期蛋白CDK2，cyclinA2表達(dá)水平相應(yīng)降低,外源性尿嘧啶可以挽救這種周期阻滯；
　　3.通過顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)lefl

7、unomide處理組中A375細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)改變， AnnexinV~FITC/PI雙染染流式細(xì)胞分析顯示在A375細(xì)胞中l(wèi)eflunomide處理組出現(xiàn)明顯的凋亡；而在MV3細(xì)胞中DMSO對(duì)照組及l(fā)eflunomide處理組中都沒有明顯凋亡；
　　4.Western Blot結(jié)果顯示與DMSO對(duì)照組相比leflunomide可誘導(dǎo)A375和MV3細(xì)胞中LC3B~Ⅰ降解成LC3B~Ⅱ，使細(xì)胞發(fā)生自噬。免疫熒光及GFP~Lc

8、3B結(jié)果顯示與DMSO對(duì)照組相比，leflunomide處理組可見明顯點(diǎn)狀LC3B聚集；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組LC3B陽性細(xì)胞百分比有顯著性差異，
　　5.臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)和MTT結(jié)果均顯示通過shRNA技術(shù)干涉DHODH可以抑制A375和MV3細(xì)胞增殖；BrdU免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)，與scramble對(duì)照組相比，干涉DHODH后BrdU陽性細(xì)胞百分比顯著降低；
　　6.PI單染流式細(xì)胞技術(shù)分析顯示：與scramble對(duì)照組相比，干

9、涉DHODH后細(xì)胞周期S期比例顯著增加，而G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著降低，通過Western Blot發(fā)現(xiàn)處理組周期蛋白CDK2，cyclinA2表達(dá)水平相應(yīng)降低。外源性尿嘧啶或者過表達(dá)DHODH可以挽救這種周期阻滯；
　　7.通過顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察、Hoechst33342染色發(fā)現(xiàn)，PI單染流式細(xì)胞分析顯示在scramble對(duì)照組或干涉DHODH組的A375和MV3細(xì)胞中均沒有明顯凋亡；
　　8.Western~Blot

10、結(jié)果顯示與scramble對(duì)照組相比干涉DHODH組可誘導(dǎo)A375和MV3細(xì)胞中LC3B~Ⅰ降解成LC3B~Ⅱ，使細(xì)胞發(fā)生自噬。免疫熒光及GFP~Lc3B結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間有顯著性差異，與scramble對(duì)照組相比，干涉DHODH組可見明顯點(diǎn)狀LC3B聚集；；
　　9.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示與DMSO對(duì)照組相比，leflunomide處理組克隆形成數(shù)顯著降低；與scramble對(duì)照組相比，干涉DHODH后細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著

11、降低。黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)異種移植NOD/SCID小鼠模型的研究結(jié)果顯示leflunomide治療組的腫瘤體積和平均瘤重，顯著低于對(duì)照組腫瘤體積和平均瘤重。
　　結(jié)論：
　　1.本研究表明兩種方法leflunomide抑制DHODH，干涉DHODH能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖及克隆形成，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明DHODH抑制劑leflunomide或者干涉DHODH可以抑制細(xì)胞體外及小鼠體內(nèi)成瘤能力。由此，DHODH可能是黑色素瘤細(xì)胞增殖及生存