金蕎麥提取物抑制黑色素瘤細(xì)胞穿越內(nèi)皮單層的機(jī)制研究.pdf

1、黑色素瘤是近幾年發(fā)病率增長較快的惡性腫瘤之一。與其它癌癥相比，黑色素瘤發(fā)病年齡相對(duì)年輕，易轉(zhuǎn)移，對(duì)化學(xué)治療和放射治療不敏感，預(yù)后差。其中轉(zhuǎn)移是黑色素瘤的特點(diǎn)之一，是造成預(yù)后差的主要因素?？刂妻D(zhuǎn)移是決定黑色素瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。開發(fā)針對(duì)轉(zhuǎn)移過程和微小轉(zhuǎn)移灶的抗惡性腫瘤藥，是提高腫瘤治愈率、降低復(fù)發(fā)和死亡率、延長患者生存期的重要途徑。但是目前臨床上尚缺乏有效地抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，而傳統(tǒng)的中藥在抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療方面展示了良好的應(yīng)用潛能。

2、　　 腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是個(gè)多因素，多步驟的過程。多倫多大學(xué)Siu教授課題組發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤細(xì)胞穿越內(nèi)皮單層的過程中，細(xì)胞膜表面的N-cadherin表達(dá)上調(diào)和E-cadherin表達(dá)下調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Src的活化增加，由此導(dǎo)致N-cadherin胞內(nèi)段磷酸化增加，致使β-catenin與N-cadherin胞內(nèi)段解離增加，胞內(nèi)游離的β-catenin增加，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)參與基因的轉(zhuǎn)錄。人為阻斷上述任意一個(gè)環(huán)節(jié)，都可不同程度的抑制黑色素瘤細(xì)胞穿

3、越內(nèi)皮單層。
　　 金蕎麥為多年生草本植物，其提取物在中國民間用以治療肺膿瘍及肺癌等。近年來我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)其具有抗癌活性，對(duì)化學(xué)致癌物二甲基苯葸(DMBA)和巴豆油誘發(fā)的小鼠皮膚乳頭狀瘤顯示明顯的抑制作用。新近利用活性追蹤法從金蕎麥根中分離出一種抗癌活性很高的原花色素縮合性單寧混合物，總單寧含量為67％，體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種金蕎麥提取物能明顯抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16細(xì)胞）的自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)其具有明顯的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，本

4、研究擬從黏附分子角度探討其抑制黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移可能的機(jī)制。
　　 方法和結(jié)果
　　 1.蘇木素染色法測(cè)定貼壁細(xì)胞增殖活性方法的建立
　　 在使用傳統(tǒng)MTT比色法和CCK-8比色法測(cè)定金蕎麥提取物對(duì)黑色素瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)上述方法無法客觀的反映藥物的作用。因?yàn)榻鹗w麥提取物與四甲基偶氮唑鹽及其衍生物發(fā)生反應(yīng)，干擾了顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與顯微鏡下所見完全相反。同時(shí)傳統(tǒng)的染色法測(cè)定細(xì)胞增殖由于對(duì)培養(yǎng)板非特

5、異吸附嚴(yán)重，而致使其準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差。
　　 蘇木素(Hematoxylin)是一種天然染料，可用于生物組織切片細(xì)胞核染色，其特點(diǎn)是僅使細(xì)胞核著色，細(xì)胞核碎裂溶解后不著色。本研究首先將蘇木素染色法用于貼壁細(xì)胞系體外增殖活性的檢測(cè)，并與MTT法、CCK-8法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其三種方法的檢測(cè)結(jié)果具有一致性。我們將蘇木素染色法用于檢測(cè)中藥提取物、化療藥物及細(xì)胞毒性細(xì)胞對(duì)貼壁細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示，蘇木素染色法各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果敏

6、感、特異，經(jīng)濟(jì)，重復(fù)性好。
　　 2.篩選合適的金蕎麥提取物濃度
　　 應(yīng)用蘇木素染色法測(cè)定金蕎麥提取物對(duì)黑色素瘤細(xì)胞(WM239)和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的毒性作用，尋找既對(duì)細(xì)胞有作用又不引起細(xì)胞死亡的合適的濃度區(qū)間和時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果表明當(dāng)金蕎麥提取物濃度不高于100μg/ml，24小時(shí)內(nèi)藥物對(duì)兩種細(xì)胞的增殖沒有明顯的抑制作用；但高于100μg/ml，或是超過24小時(shí)金蕎麥提取物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用和毒性作用就逐漸表

7、現(xiàn)出來了。
　　 3.金蕎麥提取物對(duì)WM239細(xì)胞侵襲及遷移活性的影響
　　 利用transwell小室在體外建立遷移模型，觀察不同濃度的金蕎麥提取物是否能抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著金蕎麥提取物濃度的升高，遷移到下室中的WM239細(xì)胞逐漸減少，明顯抑制WM239細(xì)胞的遷移活性。
　　 4.金養(yǎng)麥提取物對(duì)HUVEC和WM239細(xì)胞共培養(yǎng)體系N-cadherin表達(dá)的影響
　　 用不同濃度

8、的金蕎麥提取物干預(yù)黑色素瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，然后應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定共培養(yǎng)體系中黑色素瘤細(xì)胞表面N-cadherin表達(dá)量的變化，觀察金蕎麥提取物是否影響對(duì)N-cadherin的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金蕎麥提取物濃度在100μg/m1以下時(shí)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞WM239膜表面黏附分子N-cadherin的表達(dá)量沒有明顯的抑制或是促使其降低的作用。
　　 5.金蕎麥提取物對(duì)N-cadherin胞內(nèi)段磷酸化及其與β-cateni

9、n結(jié)合的影響
　　 用不同濃度的金蕎麥提取物干預(yù)黑色素瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，運(yùn)用免疫沉淀技術(shù)從總蛋白中分離得到N-cadherin蛋白。然后利用Westernblot技術(shù)探測(cè)其胞內(nèi)段磷酸化的情況以及與N-cadherin連接的β-catenin的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從12.5μg/ml～100μg/ml的濃度區(qū)間里，胞內(nèi)段磷酸化的蛋白條帶灰度值比值隨著金蕎麥濃度的升高而逐漸降低，表明N-cadhe

10、rin胞內(nèi)段磷酸化的量隨濃度升高而逐漸減少。N-cadherin胞內(nèi)段連接的β-catenin量逐漸增多。
　　 6.金蕎麥提取物對(duì)Src活化的影響
　　 用不同濃度的金蕎麥提取物干預(yù)黑色素瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。然后利用Westernblot技術(shù)檢測(cè)Src的活化型P-Src蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示100μg/ml～12.5μg/ml的濃度區(qū)間里，P-src的蛋白條帶的顏色逐漸變淺，與

11、各自內(nèi)參灰度值的比值呈下降趨勢(shì)。
　　 結(jié)論
　　 1.建立了蘇木素染色法測(cè)定貼壁細(xì)胞增殖活性的方法。該法與其它方法相比，具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、重復(fù)性和準(zhǔn)確性較好等優(yōu)點(diǎn)。
　　 2.金蕎麥提取物合適的實(shí)驗(yàn)濃度為不高于100μg/ml，由此我們選定的實(shí)驗(yàn)組濃度分別為100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml.
　　 3.金蕎麥提取物明顯抑制黑色瘤細(xì)胞WM239的遷移活性，藥物抑制率與藥物