內皮素-1引起搔癢的分子機制研究.pdf

1、內皮素-1(endothelin-1，ET-1)最初由豬主動脈內皮細胞培養(yǎng)液中分離得到的一種活性肽，是目前已知最強的縮血管活物質。除內皮細胞外，還發(fā)現角質形成細胞、血管平滑肌細胞、白細胞、心肌細胞及間質細胞及一些腫瘤細胞也發(fā)現能分泌ET-1。ET-1通過兩種G蛋白耦聯的受體(G-protein-coupled receptor，GPCR)，ETA和ETB受體發(fā)揮作用。ETA受體主要在血管內皮、神經元及肥大細胞發(fā)現有表達，而ETB受體主要

2、在角質形成細胞、血管平滑肌細胞及內皮細胞、神經膠質細胞等表達。
　　 辣椒素可引起新鮮分離的背根神經節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經元細胞內向電流及細胞內游離鈣濃度上升，ET-1可通過蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)途徑增強DRG神經元細胞內鈣對辣椒素的反應，辣椒素引起的內向電流也明顯增強。動物局部應用ET-1出現傷害性行為表現，而人局部應用ET-1出現疼痛，近年來發(fā)現人及動物局部應

3、用ET-1也出現搔癢。
　　 由同一種物質同時引起疼痛和搔癢，機體如何處理疼痛和搔癢的信息仍不得而知。ET-1引起搔癢的分子機制尚不清楚，脊髓中的胃泌素釋放肽受體(Gastrin-releasing peptide receptor， GRPR)是搔癢感受分子，選擇性去除小鼠脊髓Ⅰ層表達GRPR的神經元，動物對所有測試的致癢劑（包含ET-1在內）均無反應，提示初級神經元可能釋放不同的神經遞質，激活脊髓中痛或者癢特異性感受神經元，

4、本文主要研究ET-1引起搔癢分子信號通路。
　　 方法:
　　 實驗動物
　　 實驗選用雄性C57BL/6J小鼠，體重20-25g，由中山大學實驗動物中心提供，本研究及實驗動物的使用與處理方法得到廣東醫(yī)學科學院動物試驗倫理委員會的書面同意，并按照規(guī)定遵守動物福利及盡可能減少使用動物的數量。
　　 頸背部注射搔癢模型
　　 小鼠于實驗前一天頸背部皮膚剃毛，小鼠于實驗前30min放置于透明的塑料盒子里

5、預適應。應用30G針頭進行頸背部皮內注射，注射藥物后立即放入塑料盒子里面觀察，觀察小鼠用后肢搔抓注射部位次數，小鼠完成從舉起后肢搔抓注射部位到放下后肢全過程為一次搔抓，觀察30m in。
　　 臉頰部注射行為學觀察
　　 實驗前一天小鼠臉頰部剃毛，實驗前放置于透明的塑料盒子預適應30min，小鼠從盒子里面取出后用微量注射器（將30G針頭與微量注射器相連）進行臉頰部皮內注射，注射容量為10μl。注射藥物后立即放入塑料籠子里

6、面觀察，記錄30min內動物分別用前肢拂和后肢搔抓注射部位的次數，用注射側前肢拂注射部位是疼痛相關的行為學表現，用后肢搔抓注射部位是搔癢相關的行為學表現。
　　 熱痛覺閾值
　　 熱痛覺閾值測量實驗前一天，小鼠在實驗臺適應1h，測定熱痛覺閾值時，用熱輻射刺激儀照射小鼠足底緊貼玻璃板部位。記錄照射開始至小鼠出現明顯逃避的時間，調節(jié)光照強度，使注射藥物前逃避時間(paw withdraw time，PWT)為(8～12)s。

7、為避免熱損傷，光照時間不超過20 s。
　　 去TRPV1神經元小鼠制作
　　 雄性新生小鼠于出生后第二天七氟醚麻醉后皮下注射辣椒素(50 mg/kg)，對照組注射同樣容量的溶劑(PBS含10％ ethanol與10％ Tween-80)，動物在SPF動物房里面飼養(yǎng)6周后進行實驗。新生期注射辣椒素能夠去除表達TRPV1神經元，用角膜刺激實驗驗證去除TRPV1神經元的效果，用0.01％辣椒素20μl噴到小鼠眼睛上，小鼠會用

8、前肢拂眼睛，記數1 min內用前肢拂眼睛的次數，如1 min內用前肢拂眼睛的次數少于5次就認為已經成功去除TRPV1神經元。
　　 背根神經節(jié)神經元細胞培養(yǎng)
　　 C57BL/6J小鼠用七氟醚麻醉后背部皮膚消毒，剪下脊柱后快速轉移至放置于冰上培養(yǎng)皿內，將脊柱泡在冷的L15內，無菌狀態(tài)下取出DRG，用0.25％膠原酶Ⅳ于37℃水浴振蕩1h，機械吹打后用低溫離心機在下離心(1000rpm)5 min。培養(yǎng)液為含10％胎牛血清

9、的Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)，加入青霉素G鈉鹽和硫酸鏈霉素各10μg/ml，并且加入神經生長因子50 ng/ml，細胞接種于多聚左旋賴氨酸包被的玻片或培養(yǎng)板上，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
　　 PKCε膜轉位
　　 細胞接種于多聚左旋賴氨酸包被的直徑為10mm玻片上，用0.01 M磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗脫培

10、養(yǎng)液后，加入PBS或ET-1后放入37℃及5％ CO2培養(yǎng)箱內60 s后吸出上清，用4％PFA固定20 min，漂洗后使用含10％的山羊血清室溫下作用1h，加入第一抗體，分別為兔來源抗PKCε抗體(1∶500)及豚鼠來源的抗TRPV1抗體(1∶3000)，并加入0.2％Triton4℃下孵育16h，漂洗后加入結合有Alexa Fluor594抗兔IgG和結合有Alexa Fluor488抗豚鼠IgG的第二抗體孵育2h。用激光共焦顯微鏡(

11、Zeiss，Germany)觀察PKCε膜轉位情況。
　　 細胞內cAMP檢測
　　 細胞接種于多聚左旋賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板上，倒去培養(yǎng)液，用PBS沖洗后，加入含磷酸二酯酶抑制3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX，2.5 mM)的PBS（含0.1％葡萄糖）在37℃培養(yǎng)箱內孵育10 min，吸出培養(yǎng)液，加入含IBMX(2.5 mM)及ET-1(10nM)的PBS（

12、對照組只加入IBMX）繼續(xù)孵育60 s，倒去培養(yǎng)液，每孔加入細胞裂解液250μl(0.1 M HCl，0.8％ Triton X-100)，室溫下放置10 min，吸出后離心（10000rpm）2 min取上清，上清100μl應用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)測量標本中cAMP水平，采用小鼠cAMP單克隆抗體ELISA檢測試劑盒檢測。用純化的山羊抗小鼠抗體IgG包被96孔

13、板，制成固相抗體，在實驗前20min準備好所有試劑及酶聯板放置于室溫，往包被抗體的96孔板中依次加入cAMP標準品或樣品、小鼠單克隆cAMP抗體、辣根過氧化物酶（horse-radish peroxidase， HRP）結合的cAMP，經過徹底洗滌后用底物四甲基聯苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的cG

14、MP呈正相關。用在450 nm波長下測定吸光度（OD值），根據標準品濃度吸光度曲線測量樣品濃度。
　　 另取上清50μl應用二喹啉甲酸蛋白質試劑盒(bicinchoninic acid protein assay kit，BCA protein assay kit)測量蛋白含量，測量562 nm處吸光度，根據標準品濃度吸光度曲線計算樣品蛋白濃度。我們將細胞內cAMP濃度根據蛋白含量進行校正比較，最終細胞內cAMP濃度單位表達為p

15、mol/mg蛋白。
　　 結果:
　　 1 ET-1通過激活ETA受體引起搔癢
　　 當頸背部皮內注射100μl濃度為10μM（總量為1000 pmol）的ET-1時產生明顯的搔抓，30 min內小鼠用后肢抓注射部位的次數達到360次，依次稀釋10倍發(fā)現頸背部皮內注射總量為1 pmol（此時濃度僅為0.01μM）ET-1仍可引起明顯搔抓，當注射總量為100 pmol時30 min內引起搔抓187次，從ET-1引起

16、搔癢的劑量反應關系可以看到這一劑量（1μM，100μl）引起中等程度的搔抓次數，我們以后的研究中除非特別說明均采用這一劑量的ET-1(1μM，100μl)。
　　 臉頰部注射ET-110μM（容量為10μl）可引起明顯后肢搔抓與前肢拂注射部位，注射ET-11μM引起明顯后肢搔抓，但前肢拂注射部位不明顯，而注射ET-10.1μM不能引起明顯的后肢搔抓與前肢拂注射部位。
　　 特異性ETA受體拮抗劑BQ123及特異性ETB受

17、體拮抗劑BQ788單獨頸背部皮內注射時并不引起明顯的搔抓反應，BQ123100 nmol與100 pmol ET-1共同注射時可明顯抑制ET-1引起的搔抓，而BQ78830 nmol與100 pmol ET-1共同注射時可明顯增加ET-1引起的搔抓，說明ET-1通過ETA受體引起搔癢，而ETB受體可能發(fā)揮止癢作用。
　　 2 PKC途徑介導ET-1引起的搔癢
　　 雙吲哚亞酰胺Ⅰ(BisindolylmaleimideⅠ

18、，BIM)是蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)抑制劑，BIM2μg或10μg與ET-1共同注射均能明顯抑制ET-1引起的搔癢，說明ET-1引起的搔癢和PKC途徑有關。培養(yǎng)的DRG神經元用ET-1(10nM)處理后可見PKC￡主要分布在細胞膜上，而未用ET-1處理的DRG神經元可見PKCε主要分布在細胞漿內。
　　 巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-aceta

19、te，PMA)是常用的PKC激活劑，頸背部皮內注射PMA1μM和10μM時（總量分別為100pmol與1000 pmol）時引起搔癢，而注射10 pmol時不引起明顯搔癢。
　　 足底注射PMA與ET-1均能引起熱痛覺過敏，小鼠足底注射PMA100pmol/10μl一直出現抬足等行為，不能測量熱痛覺閾值，10 pmol/10μl引起明顯的熱痛覺過敏，1 pmol/10μl引起的熱痛覺過敏ET-1100 pmol/10μl所引起的

20、熱痛覺過敏相當，足底注射1μg BIM15 min后可以完全抑制同一部位注射ET-1和PMA引起的熱痛覺過敏。
　　 3 cAMP-PKC途徑介導ET-1引起的搔癢
　　 由磷酯酶C(phospholipase C，PLC)激活PKC是PKC激活的經典通路，我們應用PLC阻滯劑U73122觀察PLC通路的作用。頸背部注射U73122(10 pmol，100μl)不引起明顯搔抓及其他異常表現，但與預期結果相反，U73122

21、(100 pmol)與ET-1共同注射明顯增加ET-1引起的搔抓次數。提示可能由非經典通路環(huán)單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)激活PKC從而介導ET-1引起的搔癢。
　　 ET-1(10nM)刺激培養(yǎng)的DRG神經元60 s后，應用cAMP單克隆抗體ELISA法測量細胞內cAMP濃度的變化，ET-1處理神經元后明顯增加細胞內cAMP濃度。直接應用腺苷酸環(huán)化酶(Adenylyl cy

22、clase，AC)抑制劑SQ22536對ET-1引起搔癢的作用。SQ22536與ET-1共同注射可劑量依賴性地抑制ET-1引起的搔癢。AC激活后引起細胞內cAMP濃度升高，cAMP濃度升高引起蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)激活，PKA阻滯劑H89與ET-1共同皮內注射對ET-1引起的搔癢無明顯作用。
　　 為了排除U73122的非特異性作用，我們研究了更高濃度的U73122對ET-1及復合物48/80(c

23、ompound48/80，C48/80)引起搔癢的影響。C48/80可刺激培養(yǎng)的肥大細胞脫顆粒釋放組胺，U73122(10μM)可明顯抑制肥大細胞的脫顆粒。C48/80皮內注射可引起明顯的搔癢，與U73122(1000 pmol)共同注射后引起的搔癢可明顯減輕，而U73122(1000 pmol)仍然增加ET-1引起的搔癢。皮內注射phosphatidylcholine specific phospholipase C（磷脂酰膽堿磷酯酶

24、C，PC-PLC）抑制劑D609，15 min再在同一部位注射ET-1或者C48/80，D609可抑制ET-1引起的搔癢，而D對C48/80引起的搔癢無明顯影響。
　　 4 TRPV1、H1R、TRP、TRPA1在ET-1引起搔癢中的作用
　　 腹腔注射TRPV1拮抗劑辣椒平(4 mg/kg)或者H1R拮抗劑美吡拉敏(mepyramine，40 mg/kg)對ET-1引起的搔癢無明顯影響。新生期注射辣椒素后能去除TRPV

25、1神經元，ET-1在新生期注射辣椒素成年動物不引起明顯搔癢，而對照組成年動物對ET-1引起的搔癢反應無明顯影響。非選擇性TRP抑制劑釕紅(ruthenium red，RR，5 nmol)共同注射可增加ET-1引起的搔癢，但同樣劑量的RR抑制組胺引起的搔癢。TRPA1拮抗劑AP18(100 nmol)共同注射可增加ET-1引起的搔癢，同樣劑量的AP18對組胺引起的搔癢無明顯作用。ET-1引起的疼痛可能與TRPA1有關，RR與AP18增加E

26、T-1引起的搔癢可能與其減少疼痛有關。在皮內注射ET-1前15 min皮下注射嗎啡(5 mg/kg)，嗎啡對ET-1引起的搔癢無明顯影響，提示ET-1引起的搔癢與疼痛無關。
　　 5 ETB受體的止癢作用
　　 皮下注射納洛酮0.5mg/kg可明顯抑制15min后皮內注射ET-1所引起的搔癢，而小劑量的納洛酮(2 nmol)皮下注射對ET-1引起的搔癢無明顯影響，當納洛酮與ET-1共同一起皮內注射時，兩種劑量的納洛酮(2

27、nmol與0.5mg/kg)均明顯增加ET-1引起的搔癢，這種作用與納洛酮的全身作用無關，因為全身應用納洛酮的效果與此相反或者在小劑量的時候無明顯效果。
　　 外周存在μ、κ、δ三種阿片類受體亞型，我們應用選擇性亞型拮抗劑來觀察各亞型的作用，大劑量KOR拮抗劑Nor-BNI（超過15nmol/50μl時）頸背部皮內注射時可引起搔癢，而5nmol/50μl時不引起明顯搔癢，我們選擇了這一劑量進行研究，其他的劑量參考以前的研究，MO

28、R拮抗劑CTOP或DOR拮抗劑naltrindole一起注射對ET-1引起的搔癢無明顯影響，而Nor-BNI明顯增加ET-1引起的搔癢，可見外周KOR介導了ETB受體的止癢作用。
　　 KOR激動劑的抗傷害作用與一氧化氮有關，一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase)有內皮型(endothelia)、神經型(neuronal)和誘導型(inducible)三種亞型，nNOS抑抑劑可拮抗KOR激動劑的止痛作用。應用非

29、選擇性NOS抑制劑發(fā)現L-NAME(200 nmol)明顯增加ET-1引起的搔癢，而D-NAME對ET-1引起的搔癢無明顯影響。NOS有三種亞型分別為內皮型、神經型、誘導型，應用特異的選擇性亞型抑制劑與ET-1共同注射，eNOS抑制劑(L-NIO，200 nmol)可明顯增加ET-1引起的搔癢，而誘導型iNOS抑制劑(AMT,5nmol)、神經型nNOS亞型抑制劑(Nω-Propyl-L-arginine，20 nmol)對ET-1引起

30、的搔癢無明顯作用。由于神經元中主要存在nNOS，角質形成細胞中主要存在eNOS，eNOS抑制劑也能增加ET-1引起的搔癢說明KOR激動劑可能通過角質形成細胞起作用。
　　 結論:
　　 1 ET-1通過ETA/AC/PKC途徑引起搔癢。
　　 2由cAMP激活PKC是非經典途徑，這個通路通過Epac(exchange proteinsactivated directly by cyclic AMP，cAMP直接激

31、活的交換蛋白)激活下游PLC與PLD，在體內與體外實驗均發(fā)現從cAMP激活PKC離不開PLC與PLD的作用，本研究中PLC抑制劑U73122與預期相反的作用，說明ET-1引起搔癢的cAMP激活PKC通路與以前發(fā)現的通路不同，我們發(fā)現了一個全新的由cAMP激活PKC通路，該通路可能與PC-PLC通路有關。
　　 3 ETB受體發(fā)揮止癢作用，外周阿片類受體κ亞型通過eNOS介導這一止癢作用，角質形成細胞釋放的NO也可能發(fā)揮止癢作用。