辣椒素受體在外周應(yīng)用內(nèi)皮素-1致痛作用中的研究.pdf

1、內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是一含21個(gè)氨基酸的多肽，最先于1988年發(fā)現(xiàn)由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，有很強(qiáng)的縮血管作用。近年來發(fā)現(xiàn)在急慢性炎性疼痛、神經(jīng)性疼痛、腫瘤性疼痛，特別是骨轉(zhuǎn)移性癌疼痛中的痛覺過敏與自發(fā)痛中的形成維持起重要作用。 辣椒素受體TRPV1(transientreceptorpotentialvanilloidsubtype1)是1997年才克隆成功的，TRPV1是一種多型信號(hào)探測(cè)器及多種疼痛刺激

2、的整合器，可被辣椒素類物質(zhì)、熱刺激(43℃)和氫離子(proton)激活，在疼痛的發(fā)病機(jī)制中占有很重要的地位，許多炎性介質(zhì)通過活化TRPV1而發(fā)揮致痛作用。一直是近年來疼痛領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)， 體外研究發(fā)現(xiàn)ET-1可增強(qiáng)辣椒素引起背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度上升的幅度，小鼠足底注射ET-1可促進(jìn)辣椒素引起的傷害性作用，本文通過使用敲除TRPV1基因的小鼠從整體動(dòng)物水平上來研究探討TRPV1在外周應(yīng)用ET-1引起疼痛中的作用，通過

3、應(yīng)用膜片鉗技術(shù)了解細(xì)胞水平機(jī)制，旨在進(jìn)一步了解一些慢性疼痛，骨轉(zhuǎn)移痛的發(fā)病機(jī)制，從而對(duì)于緩解與治療疼痛的研究發(fā)揮一定的作用，并進(jìn)一步完善對(duì)辣椒素受體的研究。 (一)材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料雄性5周齡TRPV1基因敲除小鼠(KO小鼠)及其野生型C57BL/6小鼠(WT小鼠)分為KO組及WT組。 2.分組內(nèi)臟痛研究KO小鼠與WT小鼠按50μg/Kg、25μg/Kg、12.5μg/Kg、4μg/Kg、0μg/Kg

4、腹腔內(nèi)注射ET-1(每組每一劑量n=10)，進(jìn)行藥物注射后小鼠的行為學(xué)觀察，并記錄扭體反應(yīng)的情況。 熱痛覺研究KO小鼠與WT小鼠分別按0pmol、3pmol、10pmol、30pmol、100pmol的劑量足底注射ET-1(每組每一劑量n=6)，測(cè)量注藥前與注藥后15min、30min、45min及60min熱痛覺閾值。 自發(fā)痛研究K0小鼠與WT小鼠分別按0pmol、30pmol、100pmol、400pmol(每一劑量

5、n=6)的劑量足底注射ET-1，觀察一小時(shí)之內(nèi)動(dòng)物咬或舔注射側(cè)下肢的時(shí)間。 ETA拮抗劑和PKC抑制劑對(duì)ET-1引起熱痛覺過敏作用的研究WT小鼠分為PBS對(duì)照組、內(nèi)皮素受體A亞型(endothelinAreceptor，ETA受體)拮抗組、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)阻滯組(n=6)，PBS對(duì)照組足底皮下注射PBS10μL15min后足底注射10pmolET-1，ETA受體拮抗組足底皮下注射BQ1233nm

6、ol20min后足底注射10pmolET-1，PKC阻滯組足底皮下注射5nmolBisindolylmaleimideI15min后再注射10pmolET-1，測(cè)量注藥前、最后一次注藥后15min、30min、45min及60min的熱痛閾值。 ET-1對(duì)辣椒素引起DRG神經(jīng)元全細(xì)胞電流的作用培養(yǎng)DRG神經(jīng)元細(xì)胞，應(yīng)用膜片鉗進(jìn)行全細(xì)胞電流記錄，記錄10nMET-1灌流100s前后100nM辣椒素10s引起全細(xì)胞電流的變化。

7、 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法發(fā)生一次以上的扭體為陽性，為計(jì)數(shù)資料，扭體反應(yīng)陽性率=扭體陽性動(dòng)物只數(shù)/10*100％，兩組之間的陽性率比較采用x2檢驗(yàn)。其它結(jié)果用x±s表示，組內(nèi)藥物注射前后的檢驗(yàn)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，電生理學(xué)數(shù)據(jù)使用非配對(duì)t檢驗(yàn)，其它數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后采用Newman-Keulspost-hoc檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (二)結(jié)果 兩組動(dòng)物腹腔內(nèi)注射ET-1后均出現(xiàn)扭體，但WT組在各劑量時(shí)扭體反應(yīng)發(fā)生率均明顯高于K

8、O組，扭體次數(shù)在劑量為50μg/Kg、25μg/Kg、12.5μg/Kg時(shí)明顯高于KO組。 兩組動(dòng)物ET-1足底注射后熱痛閾值降低，在WT組降低幅度更明顯，WT組熱痛閾值隨著ET-1劑量的增加而降低，KO組劑量達(dá)到100pmol時(shí)熱痛閾值降低幅度小于30pmol時(shí)熱痛閾值降低幅度。除WT組ET-1注射劑量為3pmoI外，注射ET-1后15min時(shí)逃避反應(yīng)的時(shí)間縮短最為明顯，后漸漸恢復(fù)。而KO組恢復(fù)要快于WT組，WT組注射100p

9、mol在一小時(shí)后仍不能恢復(fù)，KO組在注射藥物45min后已全部恢復(fù)。 WT與KO小鼠足底注射PBS后無明顯自發(fā)痛表現(xiàn)，注射30pmol的ET-1在WT組引起自發(fā)痛。WT組足底注射ET-1后咬或舐注射側(cè)肢體的時(shí)間明顯長(zhǎng)于KO組。 提前注射3nmolBQ123或5nmolBisindolylmaleimideI可完全抑制隨后注射l0pmol的ET-1引起的熱痛覺過敏，注射PBS對(duì)隨后注射ET-1引起的熱痛覺過敏沒有影響。