辣椒素受體在大鼠神經(jīng)痛疼痛發(fā)生機制中的作用.pdf

1、目的：辣椒素受體(vanilloid receptor type1,VR1)于1997年被克隆,是一種非選擇性陽離子通道蛋白質(zhì),主要分布于傷害性感覺神經(jīng)元。它可被化學(xué),機械和熱刺激如溫度(>43℃)、酸(pH<6,0)等激活,使陽離子(主要是Ca2+)從胞外進入胞內(nèi),從而產(chǎn)生痛覺。雖然已有少量文獻報道在各種神經(jīng)痛疼痛模型中,辣椒素受體的表達都會發(fā)生變化,但是對于辣椒素受體在神經(jīng)痛疼痛發(fā)生機制中的作用仍然不是很清楚。本實驗擬應(yīng)用RNA干擾

2、技術(shù),以脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)神經(jīng)痛模型大鼠為實驗動物,揭示辣椒素受體在神經(jīng)痛疼痛發(fā)生機制中的作用。
　　 方法：本實驗首先構(gòu)建靶向大鼠辣椒素受體的siRNA慢病毒載體(pRNAT-U6.2/Lenti-siVR1),并用蛛網(wǎng)膜下腔注射的方式將其注射到正常大鼠體內(nèi),鑒定其是否可以在整體水平沉默VR1的表達。另一方面,制作脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)神經(jīng)痛大鼠模型,觀察疼痛行為的經(jīng)時變化過程,找出疼痛最敏感最穩(wěn)定的時期進行后續(xù)研究。此后制作

3、SNL大鼠模型并分三組,分別是陽性組(注射pRNAT-U6.2/Lenti-siVR1)、陰性組(注射無關(guān)序列)及模型組(不做任何處理)。在SNL手術(shù)后第5天將所合成的DRNAT-U6.2/Lenti-siVR1注射到大鼠蛛網(wǎng)膜下腔,特異性地使SNL大鼠辣椒素受體的mRNA降解,從而使該基因的表達沉寂。從行為學(xué)上觀察神經(jīng)痛大鼠的疼痛行為是否會有所改善,同時應(yīng)用RT-PCR技術(shù)半定量檢測辣椒素受體的mRNA是否會下降,應(yīng)用Western

4、Blot技術(shù)檢測辣椒素受體蛋白的表達是否會下降。
　　 結(jié)果：本實驗成功構(gòu)建靶向辣椒素受體的siRNA慢病毒載體(pRNAT-U6.2/Lenti-siVR1),經(jīng)動物整體實驗證實其可以沉默VR1mRNA的表達。蛛網(wǎng)膜下腔注射pRNAT-U6.2/Lenti-siVR16小時后,陽性組和陰性組大鼠的縮足閾(PWT)沒有顯著差異性,即此時SD大鼠仍然處于痛覺過敏時期。但12、24小時后,陽性組大鼠的PWT明顯升高,分別為9.7g±

5、2.4g、10.9±2.8g,而陰性組大鼠的PWT分別為3.8g±0.7g、3.9g±0.8g,陽性組與陰性組比較有顯著差異(P<0.05)。蛛網(wǎng)膜下腔注射siVR148小時后,陽性組和陰性組大鼠的PWT差異性消失(P>0.05),其PWT分別為5.2±1.3g、4.9±1.8g。在RT-PCR試驗中,可以觀察到注射12小時后,陽性組大鼠與陰性組大鼠相比,其脊髓背角和DRG神經(jīng)元內(nèi)辣椒素受體的mRNA均顯著降低,脊髓背角VR1mRNA降

6、低了約48.7％,而DRG mRNA約為51.4％；而陰性組與正常組及模型組相比較,無論是脊髓背角還是DRG神經(jīng)元其mRNA并沒有顯著性差異。Western Blot實驗也證實了辣椒素受體蛋白的表達也會降低,脊髓背角VR1蛋白降低了約44.3％,而DRG mRNA約為62.4％；而陰性組與正常組及模型組相比較,無論是脊髓背角還是DRG神經(jīng)元其蛋白表達都沒有顯著性差異。
　　 結(jié)論：本實驗所構(gòu)建的靶向大鼠辣椒素受體的siRNA慢病