松弛素-內(nèi)皮素-1平衡漂移對(duì)系統(tǒng)性硬皮病纖維化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分系統(tǒng)性硬皮病患者外周血松弛素/內(nèi)皮素-1漂移的研究
　　目的:檢測(cè)系統(tǒng)性硬皮病(systemic scleroderma，SSc)患者外周血松弛素(relaxin，RLN)和內(nèi)皮素-1(endotheline-1，ET-1)的濃度，探討二者濃度變化與SSc患者疾病特征的聯(lián)系。
　　方法:入組門(mén)診或住院SSc患者51人（年齡范圍為19-75歲），同時(shí)入組與SSc患者性別相同、年齡相似的健康志愿者51人作對(duì)照。SSc患者

2、分為局限皮膚型和彌漫皮膚型兩種亞型。觀察指標(biāo)主要包括血清ET-1和RLN的濃度、內(nèi)臟受累情況、抗核抗體(ANA)和抗-Scl-70抗體。血清RLN和ET-1的濃度采用ELISA法檢測(cè)。采用單因素或雙因素方差分析（多重比較采用Bonferroni's post-t檢驗(yàn)）、多變量方差分析和logistic回歸分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:相對(duì)于健康對(duì)照者，SSc患者血清ET-1和RLN的濃度均顯著升高(P＜0.001)。多變量方差分析

3、顯示，SSc分別與血清RLN濃度和血清ET-1濃度之間的相關(guān)性存在顯著差別(P＜0.001); logistic回歸分析（預(yù)測(cè)模型）顯示，對(duì)于預(yù)測(cè)SSc，血清RLN濃度的OR值(1.165，95％ confidence interval1.097-1.264)高于血清ET-1濃度的OR值(1.061，95％ confidence interval1.034-1.095)。與育齡女性相比，男性和絕經(jīng)女性患者血清ET-1濃度增加(P＜0.0

4、1)而血清RLN濃度降低（P＜0.05）。有內(nèi)臟受累的SSc患者血清ET-1濃度高于無(wú)內(nèi)臟受累的SSc患者(P＜0.001);血清RLN濃度與SSc患者內(nèi)臟受累與否無(wú)顯著的相關(guān)性（P＞0.05）。血清ET-1和RLN濃度與SSc臨床亞型、ANA及抗Scl-70抗體之間無(wú)顯著的相關(guān)性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:SSc患者外周血ET-1和RLN的濃度高于正常人,且外周血ET-1和RLN的濃度隨性別、女性生理期（育齡或絕經(jīng)）的變化而改

5、變。與血清ET-1濃度相比，血清RLN濃度對(duì)患SSc有更好的預(yù)測(cè)價(jià)值，但SSc患者血清ET-1水平升高可能提示內(nèi)臟受累。
　　第二部分松弛素/內(nèi)皮素-1漂移對(duì)系統(tǒng)性硬皮病患者成纖維細(xì)胞增殖、活化表型和膠原合成/降解代謝的影響
　　目的:研究松弛素(relaxin，RLN)/內(nèi)皮素-1(endotheline-1，ET-1)漂移對(duì)系統(tǒng)性硬皮病(systemic scleroderma，SSc)患者皮膚成纖維細(xì)胞的增殖、活化表型

6、的表達(dá)和膠原合成/降解代謝的影響。
　　方法:局麻下切取SSc患者皮損和正常人皮膚，進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)并傳代。取第3-6代細(xì)胞，以單用ET-1(0.25mg/L)或聯(lián)用ET-1（0.25mg/L）和RLN(1μg/L、10μg/L或100μg/L)的方式進(jìn)行干預(yù)。采用噻唑蘭(MTT)法測(cè)定細(xì)胞增殖:采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)成纖維細(xì)胞活化表型——α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)水平;采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)Ⅰ

7、型前膠原α1鏈(COL1A1)/COL3A1及基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)及其組織抑制劑(TIMP)-1 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:ET-1(0.25mg/L)促進(jìn)SSc患者和正常人皮膚成纖維細(xì)胞增殖和α-SMA的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01）。RLN（1μg/L、10μg/L和100μg/L）抑制ET-1對(duì)SSc和正常人成纖維細(xì)胞的促增殖作用（P＜0.05或P＜0.01）和促α-SMA表達(dá)的作用(P＜0.05或P＜

8、0.01)，且該抑制作用隨RLN濃度的升高而增強(qiáng)。ET-1(0.25mg/L)促進(jìn)SSc患者和正常人皮膚成纖維細(xì)胞COL1A1，COL3A1和TIMP-1 mRNA的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01）并抑制MMP-1 mRNA的表達(dá)（SSc成纖維細(xì)胞P＜0.05，正常人成纖維細(xì)胞P＜0.01）。RLN抑制ET-1的上述效應(yīng)(P＜0.05或P＜0.01)，且該抑制作用多隨RLN濃度升高而增強(qiáng)。
　　結(jié)論:在體外，ET-1促進(jìn)SSc皮

9、膚成纖維細(xì)胞的增殖并上調(diào)其活化表型α-SMA及膠原的表達(dá);RLN呈濃度依賴(lài)性地抑制ET-1的上述效應(yīng)。
　　第三部分松弛素/內(nèi)皮素-1與硬皮病小鼠器官纖維化的聯(lián)系及其機(jī)制探討
　　目的:研究松弛素(relaxin，RLN)和內(nèi)皮素-1(endotheline-1，ET-1)漂移與系統(tǒng)性硬皮病(systemic scleroderma，SSc)小鼠模型器官纖維化的聯(lián)系及其可能的機(jī)制。
　　方法:對(duì)C3H/He小鼠皮下注射

10、博來(lái)霉素(Bleomycin，BLM)每日1次、連續(xù)3周，復(fù)制硬皮病小鼠模型，并以同樣方法注射磷酸鹽緩沖液(PBS)為對(duì)照。在開(kāi)始注射BLM的首日，在小鼠肩胛部皮下置入微量滲透泵，緩釋RLN(0.5mg/kg/d)共2周，并以同樣方法緩釋其溶劑醋酸鈉(NaAc)溶液作為對(duì)照。分別于開(kāi)始BLM注射后第1、2、3、5、7周末采集小鼠血漿，采用ELISA法檢測(cè)ET-1濃度;取小鼠注射部位皮膚及肺組織，采用HE及Masson三色染色進(jìn)行組織學(xué)檢

11、查，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)皮膚和肺ET-1、Ⅰ型膠原α1鏈(COL1A1) mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:造模第3周末，與PBS組相比，BLM組小鼠真皮厚度和肺組織纖維化百分比顯著升高（P＜0.05，p＜0.001），皮膚COL1A1 mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性地升高（第3周末，P＜0.05;第5周末和第7周末，P＜0.01），肺COL1A1 mRNA則在第2周末和第3周末顯著升高(P＜0.001)。造模第3周末，與BLM+NaAc

12、組相比，BLM+RLN組小鼠皮膚厚度和肺纖維化百分比顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，皮膚COL1A1 mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性地降低（第2周末、第3周末和第5周末，P＜0.05;第7周末，P＜0.01），肺COL1A1 mRNA則在第2周末和第3周末顯著降低（P＜0.001，P＜0.01）。造模第1周末，BLM組小鼠血漿ET-1水平顯著高于PBS組，BLM+RLN組小鼠血漿ET-1水平明顯低于BLM+NaAc組(P＜0.01)，

13、此后其各自組間均無(wú)顯著差別。BLM組小鼠皮膚ET-1 mRNA的表達(dá)顯著高于PBS組(第1周末P＜0.01，第5周末和第7周末，P＜0.05)，BLM+RLN組小鼠皮膚ET-1 mRNA的表達(dá)顯著低于BLM+NaAc組（第1周末P＜0.01，第7周末P＜0.05）。造模第1周末，BLM組小鼠肺ET-1mRNA的表達(dá)高于PBS組(P＜0.01)，此后兩組無(wú)顯著差別。BLM+RLN組小鼠肺ET-1 mRNA的表達(dá)顯著低于BLM+NaAc組（