應(yīng)用膜片鉗技術(shù)研究17β-雌二醇對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞L-型鈣通道電流的影響.pdf

1、雌激素（Estrogen，E）是一種類固醇激素，其主要成分為雌二醇（Estradiol，E2）。雌二醇有α和β兩種類型，其中β型生物作用強(qiáng)。大量研究表明，雌激素除了對(duì)生殖系統(tǒng)具有調(diào)控作用以外，在治療更年期綜合征、抗骨質(zhì)疏松、預(yù)防心血管疾病及對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用等方面都有很高的研究及應(yīng)用價(jià)值。心血管系統(tǒng)疾病是絕經(jīng)后婦女病死的主要原因之一，大于50歲的婦女約53％死于心血管疾病。絕經(jīng)后婦女應(yīng)用雌激素替代療法（Estrogen Repla

2、cement Therapy，ERT）可使心血管疾病的發(fā)病率下降35％-50％，提示雌激素對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用，然而其保護(hù)作用的機(jī)制目前還不十分清楚。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)雌激素可直接作用于心肌及血管平滑肌，產(chǎn)生負(fù)性變力作用，擴(kuò)張血管，并且有證據(jù)表明雌激素對(duì)鈣通道電流有抑制作用。
　　 ERT有導(dǎo)致乳房、卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)，因此深入研究雌激素對(duì)心血管作用的保護(hù)機(jī)制，尋找一種理想的ERT藥物，盡可能地減少其副作用，將對(duì)心血管系統(tǒng)

3、疾病的防治起到重要作用。因此我們應(yīng)用膜片鉗技術(shù)研究17β-雌二醇（17p-E2）對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道電流（ICa-L）的影響，從電生理學(xué)的角度探討17β-雌二醇的心血管系統(tǒng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)安全有效的雌激素替代藥物和指導(dǎo)臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　 實(shí)驗(yàn)選用健康成年豚鼠（300-400）g，雌性。實(shí)驗(yàn)分為五組，對(duì)照組：記錄正常細(xì)胞外液灌流時(shí)豚鼠心室肌細(xì)

4、胞ICa-L；應(yīng)用17β-E2三組：分別記錄含17β-E2（10-9、10-8、10-7mol/L）的細(xì)胞外液灌流時(shí)豚鼠心室肌細(xì)胞ICa-L；17β-E2+受體阻斷劑組：用雌激素特異性受體阻斷劑三苯氧胺（Tamoxifen，TAM）（10-7mol/L）預(yù)處理1h后，記錄含17β-E2（10-7mol/L）和TAM（10-7mol/L）的細(xì)胞外液灌流時(shí)豚鼠心室肌細(xì)胞ICa-L，。
　　 2、實(shí)驗(yàn)儀器
　　 膜片鉗放大器，

5、數(shù)模轉(zhuǎn)換器，微操作器，倒置顯微鏡，微電極拉制儀，微電極拋光儀，防震臺(tái)，Langendorff灌流裝置，小型動(dòng)物呼吸機(jī)，數(shù)控超級(jí)恒溫槽，低速離心機(jī)，超聲波清洗器，恒溫水浴鍋，pH計(jì)，電子天平，磁力攪拌器，手術(shù)器械。
　　 3、溶液與藥品
　　 無(wú)鈣臺(tái)氏液（mmol/L）、含鈣臺(tái)氏液（mmol/L）、KB液（mmol/L）、電極內(nèi)液、膠原酶（Collagenase）、蛋白酶（Protease）、17β-雌二醇、三苯氧胺。

6、r>　　 4、豚鼠心室肌細(xì)胞的分離
　　 1％戊巴比妥鈉按100mg/kg腹腔注射麻醉豚鼠，氣管插管，開(kāi)胸分離主動(dòng)脈并插管，分離心臟并連接于Langendorff灌流裝置上，用普通臺(tái)氏液灌流3min后換無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流6min，再用含有0.05％膠原酶的無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流10-15min，待心室肌組織消化后，用KB液灌流終止酶的消化，取左心室機(jī)械游離單個(gè)心室肌細(xì)胞，濾網(wǎng)過(guò)濾，離心后置于KB液中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 5、

7、ICa-L的記錄方法
　　 將分離好的細(xì)胞懸液滴于倒置顯微鏡上方的浴槽內(nèi)，選擇靜止、桿狀、橫紋清晰、折光性良好的單個(gè)心室肌細(xì)胞，采用全細(xì)胞記錄模式記錄ICa-L。
　　 6、電容值的測(cè)量方法
　　 打開(kāi)一個(gè)已記錄的ICa-L數(shù)據(jù)樣本，選擇鉗制電壓下方的電壓線，確定第n個(gè)Sweep，然后在View對(duì)話框中的Select Sweep對(duì)話框中選擇相應(yīng)的第n個(gè)Sweep，按OK按鈕。調(diào)整1，2，3，4光標(biāo)，然后在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

8、圖標(biāo)的對(duì)話框中選擇相應(yīng)的條目，按OK按鈕，在Result對(duì)話框中生成相應(yīng)的曲線下面積值，將曲線下面積值除以10得到電容值。
　　 7、數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)在pCLAMP 10.0中進(jìn)行分析及測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Mean±SD表示，將給藥組和對(duì)照組進(jìn)行兩組資料t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有高度顯著性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、17β-E2對(duì)不同膜電位下豚鼠心室肌

9、細(xì)胞ICa-L的影響
　　 17β-E2（10-9、10-8、10-7mol/L）使ICa-L峰電流密度值從（-3.5± 1.4）pA/pF分別減少至（-2.5± 0.2）pA/pF、（-2.1± 0.7）pA/pF和（-1.3± 0.5）pA/pF（與對(duì)照組比較，均為P<0.01，n=5）。ICa-L峰電流密度值減少百分?jǐn)?shù)分別為26.8％、40％和62.9％。電流電壓曲線顯示17β-E2濃度越高抑制的程度越明顯，但I(xiàn)-V曲線的

10、形狀和峰值電壓無(wú)明顯變化。
　　 2、TAM預(yù)處理后17β-E2對(duì)不同膜電位下ICa-L的影響
　　 TAM（10-7mol/L）預(yù)處理后，17β-E2（10-7mol/L）使ICa-L峰電流密度值從（-3.5± 1.4）pA/pF減少至（-1.2± 0.5）pA/pF（與對(duì)照組比較，P<0.01，n=5），ICa-L峰電流密度減少百分?jǐn)?shù)為65.7％，與未應(yīng)用TAM（10-7mol/L）預(yù)處理的17β-E2（10-7mo

11、l/L）作用下ICa-L峰電流密度值（-1.3±0.5）pA/pF相比較，ICa-L峰電流密度值無(wú)顯著變化（P>0.05，n=5）。
　　 討論
　　 鈣通道是心肌細(xì)胞膜上最重要的膜蛋白之一。根據(jù)鈣通道的分子生物學(xué)及其鈣電流的動(dòng)力學(xué)特征，可將其分為長(zhǎng)時(shí)間激活型（L型）及瞬時(shí)激活型（T型），其中L型鈣通道的開(kāi)放及鈣離子內(nèi)流而產(chǎn)生的慢鈣內(nèi)向電流，在心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極和興奮-收縮偶聯(lián)過(guò)程中起重要作用，是決定心肌細(xì)胞動(dòng)作電位平

12、臺(tái)期長(zhǎng)短的重要因素。
　　 本研究應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法，觀察了17β-E2對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞ICa-L的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)17β-E2可抑制ICa-L，且抑制作用呈濃度依賴性，推測(cè)17β-E2可能通過(guò)抑制ICa-L縮短動(dòng)作電位平臺(tái)期。抑制內(nèi)向鈣電流或促進(jìn)外向鉀電流均使動(dòng)作電位平臺(tái)期縮短，17β-E2是否促進(jìn)鉀外流目前還不清楚。17β-E2抑制ICa-L，使動(dòng)作電位時(shí)程縮短，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流減少，心肌收縮力減弱，降低心臟作功和心肌

13、氧耗。此外，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)Ca2+降低，有利于線粒體將堆積的Ca2+排出，減輕Ca2+超載，發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)17β-E2用雌激素特異性受體阻斷劑TAM預(yù)處理后，對(duì)ICa-L的抑制作用與未應(yīng)用TAM預(yù)處理相比沒(méi)有明顯變化，提示17β-E2抑制ICa-L的作用不是由雌激素核受體介導(dǎo)的，推測(cè)該作用可能是通過(guò)直接與鈣離子通道上或與鈣通道調(diào)節(jié)蛋白的某位點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生理濃度的17β-E2能

14、夠抑制ICa-L，這種抑制作用不被雌激素特異性受體阻斷劑TAM阻斷，提示17β-E2對(duì)ICa-L的作用可能未通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，而是直接作用于鈣通道或通過(guò)其他途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1、17β-E2抑制豚鼠心室肌細(xì)胞ICa-L，作用呈濃度依賴性。
　　 2、雌激素特異性受體阻斷劑TAM不能阻斷17β-E2對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞ICa-L的抑制作用，提示17β-E2對(duì)ICa-L的抑制作用可能與ER作用無(wú)關(guān)