早期維生素A營(yíng)養(yǎng)對(duì)大鼠海馬學(xué)習(xí)記憶功能的影響及機(jī)制.pdf

1、維生素A是整個(gè)生命過(guò)程中必需的微量營(yíng)養(yǎng)素，維生素A及其衍生物己被證實(shí)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能密切相關(guān)，不但在胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有重要作用，而且還參與成年期學(xué)習(xí)記憶功能。孕婦和學(xué)齡前兒童是維生素A缺乏的易感人群，尤其是容易被人們忽視的亞臨床維生素A缺乏。但是，由于維生素A過(guò)量的致畸作用，包括中國(guó)在內(nèi)的大多數(shù)國(guó)家對(duì)孕期維生素A缺乏，尤其是邊緣型維生素A缺乏(marginal vitamin A deficiency，MVAD)，并

2、未采取補(bǔ)充措施，維生素A補(bǔ)充普遍在出生后進(jìn)行。 早期營(yíng)養(yǎng)素供給不僅對(duì)近期生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響，也被證實(shí)與成年后許多疾病的發(fā)生相關(guān)，神經(jīng)系統(tǒng)正是這種程序化作用中極易受影響的器官。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)狀況直接影響大腦的生理功能，大腦的生理功能與智力水平和學(xué)習(xí)能力密切相關(guān)，因此生命早期均衡營(yíng)養(yǎng)是維持大腦的正常發(fā)育和功能發(fā)揮的重要因素。并且，目前的觀點(diǎn)認(rèn)為幼年期和成年期的精神性疾病與胚胎期和出生早期正常發(fā)育過(guò)程受到影響有關(guān)，如多動(dòng)

3、癥、孤獨(dú)癥和阿爾茲海默病等。生物信息學(xué)和臨床研究結(jié)果都提示，維生素A與老年期認(rèn)知障礙退行性疾病——阿爾茲海默病的發(fā)生密切相關(guān)。早期營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入不足對(duì)大腦認(rèn)知功能的長(zhǎng)遠(yuǎn)期影響是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題，這些重要的營(yíng)養(yǎng)素除了蛋白質(zhì)、脂肪等，還包括礦物質(zhì)元素(鐵、鋅、碘、銅、硒)，維生素(維生素A、葉酸、維生素C、維生素D、維生素E)，及一些長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸。目前已經(jīng)證實(shí)鐵和碘等營(yíng)養(yǎng)素在生命早期的營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)大腦學(xué)習(xí)記憶功能具有長(zhǎng)期影響，而且營(yíng)養(yǎng)干預(yù)效

4、果與干預(yù)時(shí)間窗密切相關(guān)。維生素A對(duì)胚胎神經(jīng)發(fā)育的影響已有大量報(bào)道，最近有研究發(fā)現(xiàn)成年期維生素A缺乏能夠?qū)е聦W(xué)習(xí)記憶功能損傷，正常大鼠補(bǔ)充維生素A可以在一定程度上減輕老年期的學(xué)習(xí)記憶功能下降。但是，對(duì)于臨床上常見(jiàn)的早期(孕期和嬰幼兒期)維生素營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的遠(yuǎn)期持續(xù)性影響及其與老年期認(rèn)知退行性疾病的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。 綜上所述，本課題構(gòu)建MVAD孕鼠及雌性幼鼠模型，隨機(jī)分為7組：(1)正常對(duì)照組(Control組)：母鼠3只

5、，給予維生素A充足飼料(含視黃醇6500IU/kg)，幼鼠飼料同母鼠，生后8周處死；(2)邊緣型維生素A缺乏組(marginal vitamin A deficient group，MVAD組)：母鼠3只，給予維生素A部分缺乏飼料(VAD飼料，含視黃醇400IU/kg)，幼鼠飼料同母鼠，生后8周處死；(3)維生素A補(bǔ)充組(vitamin Asupplementation group,VAS組)：母鼠3只，給予維生素A缺乏組飼料至分娩，出

6、生時(shí)連續(xù)口服補(bǔ)充適量維生素A(50IU視黃醇/g.d)，補(bǔ)充后1，4，7d監(jiān)測(cè)血清視黃醇水平，同時(shí)改飼對(duì)照組飼料，7d時(shí)可監(jiān)測(cè)到血清維生素A恢復(fù)正常.幼鼠飼對(duì)照組飼料，生后8周處死。(4)老年正常對(duì)照組(OControl組)：母鼠3只，給予維生素A充足飼料，幼鼠飼料同母鼠，生后44周處死；(5)老年邊緣型維生素A缺乏組(OMVAD組)：母鼠3只，給予VAD飼料，幼鼠飼料同母鼠，為防止出現(xiàn)維生素A嚴(yán)重缺乏的臨床癥狀(如死亡、視力下降、眼盲

7、等)，分別于生后10周，生后20周和生后30周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始連續(xù)3天給予維生素A充足飼料，生后44周處死；(6)維生素A補(bǔ)充老年組Ⅰ(OVAS1組)：母鼠3只，給予VAD飼料至分娩，出生時(shí)連續(xù)7天口服補(bǔ)充適量維生素A(50IU視黃醇/g.d)，同時(shí)改飼對(duì)照組飼料，生后44周處死。(7)維生素A補(bǔ)充老年組Ⅱ(OVAS2組)：母鼠3只，給予VAD飼料至分娩，生后4周連續(xù)7天口服補(bǔ)充適量維生素A(50IU視黃醇/g.d)，同時(shí)改飼對(duì)照組飼料，

8、生后8周血清視黃醇檢測(cè)為正常水平，生后44周處死。水迷宮行為學(xué)測(cè)試早期MVAD及補(bǔ)充對(duì)仔鼠學(xué)習(xí)記憶的遠(yuǎn)期影響；檢測(cè)腦蛋白含量，電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)，免疫組化檢測(cè)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)和淀粉樣前蛋白(amyloid protein precursor，APP)在海馬組織內(nèi)表達(dá)水平，初步探討MVAD對(duì)老年期重要學(xué)習(xí)記憶退行性疾病-阿爾茲海默病發(fā)生的影響；定量PCR檢測(cè)生后早期海馬發(fā)育過(guò)程中海馬視黃酸代謝酶的表達(dá)，高效液相

9、檢測(cè)血清和海馬組織視黃醇、RA水平，探討生后早期發(fā)育過(guò)程中海馬視黃酸代謝情況和早期維生素A營(yíng)養(yǎng)缺乏及補(bǔ)充對(duì)海馬視黃酸代謝的影響；定量PCR、免疫組化和激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)生后早期海馬發(fā)育過(guò)程中視黃酸受體的定量定位表達(dá)改變，研究視黃酸受體在生后早期海馬發(fā)育過(guò)程中的重要作用(詳見(jiàn)技術(shù)路線圖)?；谡n題組前期研究結(jié)果，觀察了MVAD對(duì)海馬學(xué)習(xí)記憶功能的遠(yuǎn)期影響，進(jìn)一步從海馬視黃酸代謝和視黃酸受體表達(dá)模式兩個(gè)方面探討了維生素A及其活性代謝產(chǎn)物視黃

10、酸在早期海馬發(fā)育及功能中的作用。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.早期邊緣型維生素A缺乏對(duì)仔鼠海馬學(xué)習(xí)記憶功能的損傷具有遠(yuǎn)期持續(xù)性影響，水迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)從胚胎期開(kāi)始的邊緣型維生素A缺乏大鼠在生后8周和生后44周時(shí)均出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶行為明顯受損，邊緣型維生素A缺乏對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響一直持續(xù)到老年期。出生時(shí)補(bǔ)充組和生后4周補(bǔ)充組，在不同年齡階段學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)程度不同，出生時(shí)補(bǔ)充組生后8周(成年時(shí))時(shí)學(xué)習(xí)記憶水平與正常組之間存在差異，在生后44

11、周進(jìn)行測(cè)試，可以觀察到其空間學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)正常，這可能與邊緣型維生素A缺乏影響胚胎期腦發(fā)育，延緩幼年期學(xué)習(xí)記憶功能的成熟相關(guān)。值得注意的是，出生4周才開(kāi)始補(bǔ)充維生素A的仔鼠學(xué)習(xí)記憶功能在成年期(前期實(shí)驗(yàn))和老年期均明顯降低，提示早期維生素A營(yíng)養(yǎng)干預(yù)對(duì)于恢復(fù)遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能損傷的作用存在“窗口期”，錯(cuò)過(guò)了有效干預(yù)時(shí)期將導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能損傷難以恢復(fù)。 2.海馬組織超微結(jié)構(gòu)觀察持續(xù)邊緣型維生素A缺乏導(dǎo)致仔鼠海馬神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損

12、傷，神經(jīng)元脂褐素堆積增多，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)老化，用大鼠特異性抗體分別對(duì)正常和MVAD仔鼠生后44周海馬組織切片染色分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)組海馬組織內(nèi)均未見(jiàn)明顯Ap蛋白表達(dá)，但MVAD導(dǎo)致APP蛋白表達(dá)增加，有可能是邊緣型維生素A缺乏影響APP代謝而造成APP蛋白在海馬組織中堆積，這使形成淀粉樣蛋白斑的潛在風(fēng)險(xiǎn)增加，提示邊緣型維生素A缺乏影響遠(yuǎn)期海馬結(jié)構(gòu)和功能，可能提高老年期學(xué)習(xí)記憶退行性疾病--阿爾茲海默癥患病風(fēng)險(xiǎn)。 3.仔鼠外周血和海馬視

13、黃醇--視黃酸系統(tǒng)對(duì)早期邊緣型維生素A缺乏的應(yīng)答并不一致。在MVAD組，我們觀察到由于食物來(lái)源的維生素A減少，血清中的視黃醇濃度明顯降低，當(dāng)給予維生素A補(bǔ)充時(shí)，血清視黃醇濃度恢復(fù)到正常水平，但是，海馬中的視黃醇和視黃酸濃度并不隨血清中的視黃醇和視黃酸濃度而改變，能夠保持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍。對(duì)海馬視黃醇和視黃酸的濃度與大鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是海馬視黃醇還是視黃酸，與學(xué)習(xí)記憶行為的改變都無(wú)明顯相關(guān)性。因此，在維生素A供給和血

14、清視黃醇水平發(fā)生改變的狀態(tài)下，海馬組織視黃醇和視黃酸濃度能夠穩(wěn)定一定范圍，這可能是海馬的自我保護(hù)機(jī)制；早期邊緣型維生素A缺乏及補(bǔ)充對(duì)海馬RA濃度影響不大，其導(dǎo)致的空間學(xué)習(xí)記憶損害可能由其他機(jī)制引起。 4.早期邊緣型維生素A缺乏引起分離的海馬組織RALDH2表達(dá)主動(dòng)性降低，而RALDH1出現(xiàn)補(bǔ)償性的表達(dá)升高，同時(shí)，CYP26A1的表達(dá)也出現(xiàn)代償性降低。在海馬視黃醇供給充足的狀態(tài)下，合成酶只有部分表達(dá)降低，分解途徑受到抑制，結(jié)果正如

15、我們觀察到的，海馬視黃酸濃度保持穩(wěn)定，atRA在MVAD組海馬組織中還出現(xiàn)了顯著升高。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)維生素A營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后RALDH2和CYP26A1都恢復(fù)到正常水平，但升高的RALDH1水平并沒(méi)有改善，此時(shí)海馬中atRA濃度仍然高于正常。因此，視黃酸合成分解代謝酶表達(dá)可能參與海馬自身調(diào)控，是海馬的視黃醇和視黃酸濃度在維生素A不同營(yíng)養(yǎng)的狀態(tài)下能夠保持穩(wěn)定的重要機(jī)制。 5.結(jié)果顯示生后4周和生后8周海馬組織RARα mRNA和蛋白的表達(dá)

16、比出生時(shí)下降大約30％左右，在生后發(fā)育初期有一個(gè)下降過(guò)程，在斷乳期后穩(wěn)定在一定水平。在海馬的齒狀回和CA1-CA3區(qū)的錐體細(xì)胞中，大鼠生后發(fā)育后期(生后3周和生后8周)表達(dá)RARα蛋白的細(xì)胞較生后發(fā)育前期(生后1周)均明顯減少；而對(duì)于顆粒層細(xì)胞來(lái)說(shuō)，CA1-CA3區(qū)的顆粒層細(xì)胞在生后發(fā)育后期幾乎沒(méi)有觀察到RARα蛋白表達(dá)，齒狀回顆粒層細(xì)胞雖然一直有RARα蛋白，但表達(dá)水平也是逐漸降低。海馬生后發(fā)育過(guò)程中的RARα mRNA的表達(dá)變化可能

17、更主要的是與神經(jīng)細(xì)胞的修剪和成熟有關(guān)，學(xué)習(xí)記憶環(huán)路中重要的齒狀回顆粒層細(xì)胞和CA1-CA3區(qū)錐體細(xì)胞層均持續(xù)表達(dá)RARα蛋白，進(jìn)一步證實(shí)了RARα在成年海馬的學(xué)習(xí)記憶功能中的重要作用。 6.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在生后海馬發(fā)育成熟的過(guò)程中，海馬各區(qū)RARα受體蛋白表達(dá)存在時(shí)間有序性的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位表達(dá)現(xiàn)象。隨著海馬發(fā)育成熟，海馬細(xì)胞，尤其是錐體層細(xì)胞內(nèi)，RARα蛋白表達(dá)顯現(xiàn)出核內(nèi)向核外轉(zhuǎn)移的胞內(nèi)表達(dá)轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，生后發(fā)育早期以胞核表達(dá)為主，生后發(fā)育

18、晚期以胞漿表達(dá)為主，這種海馬神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)定位表達(dá)可能參與蛋白翻譯作用，與學(xué)習(xí)記憶功能發(fā)育密切相關(guān)。 7.早期邊緣型維生素A缺乏導(dǎo)致出生時(shí)和生后8周RARα mRNA表達(dá)降低，出生時(shí)觀察到邊緣型維生素A缺乏降低RARα蛋白表達(dá)水平，而且出現(xiàn)大量胞漿表達(dá)，使RARα胞漿表達(dá)時(shí)間點(diǎn)提前。提示孕期開(kāi)始的邊緣型維生素A缺乏損傷學(xué)習(xí)記憶功能發(fā)育中重要的視黃酸受體RARα生后發(fā)育早期程序性表達(dá)模式，可能是錯(cuò)過(guò)生后早期發(fā)育時(shí)間窗導(dǎo)致遠(yuǎn)期不可修