早期應激對海馬學習、記憶功能的作用和機制研究.pdf

1、背景：
　　 早期應激與成年后行為的變化、對應激的生理響應的變化和對精神疾病的易感性有關(guān)。動物和人的研究都已證實腦在幼兒早期對應激尤其敏感。在此期間經(jīng)歷的應激事件可能會造成神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生永久性的改變，而這些改變可能與成年時發(fā)生的精神疾病有關(guān)。母愛剝奪(maternal deprivation，MD)是一個已經(jīng)建立的成熟的早期應激動物模型，并被應用于與精神疾病病理和致病因素相關(guān)的神經(jīng)化學研究。即使在對大多數(shù)成年應激源都沒有顯著響應的

2、低應激反應期(SHRP)，持續(xù)的母愛剝奪也會產(chǎn)生十分不利的影響。海馬的許多功能都可以被早期經(jīng)歷的惡性應激所改變。首先，海馬參與HPA軸的負反饋調(diào)節(jié)。應激后造成的海馬或穹窿的損傷可以導致HPA軸的基礎調(diào)節(jié)功能恢復減慢。其次，海馬是調(diào)節(jié)與焦慮相關(guān)的行為的重要結(jié)構(gòu)。海馬損傷的大鼠在行為測試中如對新環(huán)境的探索、社會接觸等表現(xiàn)出較少的焦慮。再次，海馬在空間導向?qū)W習能力方面發(fā)揮重要作用。海馬的損傷就會對空間導向?qū)W習能力產(chǎn)生影響。早期經(jīng)歷母愛剝奪，異

3、常的海馬發(fā)育就可能導致上述情形的出現(xiàn)。
　　 目前關(guān)于母愛剝奪對海馬結(jié)構(gòu)和功能的作用機制缺乏詳盡細致的研究，因而在許多方面沒有明確的結(jié)論。本研究在前期研究的基礎上，特別考慮母愛剝奪的模式和實驗動物性別等因素，從分子機制和神經(jīng)行為學兩個角度探討母愛剝奪對海馬的學習、記憶功能的作用和機制。
　　 目的：
　　 1.觀察母愛剝奪對雌雄大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響。
　　 2.觀察不同模式的母愛剝奪對雌雄大鼠海馬的Gl

4、ucocorticoids receptors，Calretnin和Calbindin D-28k蛋白表達的影響。
　　 3.觀察母愛剝奪對雌雄大鼠成年后對應激響應的影響。
　　 方法：
　　 1)建立3種不同模式的SD大鼠的母愛剝奪模型：MD，在PND2-PND14(出生后第2天到第14天)期間，幼仔每日與母鼠分離3h(9:00-12:00)；MD4，在PND4，幼仔與母親分離24h(9:00-9:00)；MD

5、9，在PND9，幼仔與母親分離24h(9:00-9:00)。
　　 2)比較MD組和CON組(對照組)雌雄大鼠在PND21的體重。
　　 3)比較MD組和CON組(對照組)雌雄大鼠在PND21的海馬的神經(jīng)發(fā)生情況。對大鼠腦組織的冰凍切片進行免疫熒光染色，用ki67估測海馬齒狀回的細胞的增殖，用Doublecortin估測海馬齒狀回未成熟的神經(jīng)元數(shù)目。
　　 4)對MD組和CON組(對照組)雌雄大鼠在PND21進行

6、曠場測驗，比較它們的探索行為和自主活動性。
　　 5)采用western blot和QT-PCR比較MD組、MD4組、MD9組和CON組的雌雄大鼠在PND21的海馬的糖皮質(zhì)激素受體(GR)的水平。
　　 6)采用western blot和QT-PCR比較MD組、MD4組、MD9組和CON組的雌雄大鼠在PND21的海馬的ealretinin蛋白和其mRNA的表達水平。
　　 7)采用western blot和QT-

7、PCR比較MD組、MD4組、MD9組和CON組的雌雄大鼠在PND21的海馬的calbindin-D28k蛋白和其mRNA的表達水平。
　　 8)對MD組、MD4組、MD9組和CON組的雌雄大鼠在PND21進行高架十字迷宮測驗，檢測它們的焦慮狀況。
　　 9)對MD組和CON組(對照組)雌雄大鼠在PND25進行Morris水迷宮測驗，比較它們的學習、記憶能力。
　　 10)在PND35，采用western blot

8、比較參加水迷宮測試的和未參加水迷宮測試的MD組和CON組的雌雄大鼠的海馬的calretinin蛋白水平。
　　 11)在PND35，采用western blot比較參加水迷宮測試的和未參加水迷宮測試的MD組和CON組的雌雄大鼠的海馬的calbindin-D28k蛋白水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.雌性大鼠和雄性大鼠在出生后第21天的體重并沒有差別。不論是雄性大鼠還是雌性大鼠，MD組的體重都極其顯著低于對照組的(p

9、<0.001)。
　　 2.在PND21，雄性大鼠的DCX+細胞數(shù)目要顯著高于雌性大鼠的(p<0.001)。對雄性大鼠來說，MD組的DCX+細胞數(shù)目極其顯著多于對照組的(p<0.001)。對于雌性大鼠來說，MD組的DCX+細胞數(shù)目則極其顯著低于對照組的(p<0.001)。
　　 3.在PND21，雄性大鼠和雌性大鼠的ki67+細胞數(shù)目沒有顯著差別(p>0.05)。雄性大鼠的MD組的較對照組的海馬的細胞增殖減少(p<0.0

10、5)。而雌性大鼠的MD組和對照組之間的差別不具有統(tǒng)計學意義(p>0.05)。
　　 4.在曠場測試中，雄性大鼠的總運動和總運動時間都顯著高于雌性大鼠的(p<0.05)。對雄性大鼠來說，MD組的總運動距離和和總運動時間都顯著低于對照組的(p<0.05)。而雌性大鼠兩組之間沒有明顯差別(p>0.05)。
　　 5.在PND21，雄性大鼠海馬的CALR水平低于雌性大鼠的[F(1，47)=74.8，p<0.001]。Post h

11、oc比較說明，MD組和MD9組的雄性大鼠的海馬CALR表達顯著高于對照組的，而MD4組的與對照組之間沒有明顯差別。MD組的雄性大鼠的海馬的CALR比MD9組的豐富。與對照組相比，MD組、MD4組和MD9組的雌性大鼠的海馬的CALR水平都顯著增高。MD組的雌性大鼠的海馬的CALR表達高于MD4組的，而MD4組的和MD9組的差別不具有統(tǒng)計學意義。
　　 6.在PND21，雌性大鼠的海馬的CALB水平顯著高于雄性大鼠的[F(1，47)

12、=75.67，p<0.001]。MD組的MD9組的雄性大鼠的海馬的CALB表達都明顯高于對照組的，而MD4組的則低于對照組的。同時我們觀察到MD組的雄性大鼠的海馬的CALB水平高于MD9組的。對雌性大鼠來說，MD組的海馬的CALB表達顯著高于對照組的。另外，MD4組的和MD9組的CALB表達明顯降低，而MD9組的CALB水平最低。
　　 7.在PND21，雌性大鼠海馬的GR mRNA、CALR mRNA和CALB mRNA表達均

13、顯著高于雄性大鼠的。對于雄性大鼠來說，MD組和MD9組的GR.mRNA、CALRmRNA和CALB mRNA水平明顯高于對照組的，而MD4組和對照組之間沒有差別。對于雌性大鼠來說，MD組、MD4組和MD9組的GR mRNA和CALR mRNA表達均顯著高于對照組的，而MD9組和MD4組的CALB mRNA水平則低于對照組的。
　　 8.在高架十字迷宮測試中，與雌性大鼠相比，雄性大鼠在5min的測試過程中伸展次數(shù)較多，而且在開臂上

14、的停留時間較長。與對照組相比，MD組和MD9組的雄性大鼠花費較短的時間在開臂，并且站立次數(shù)、探頭次和伸展次數(shù)都顯著增加，但是MD4組的雄性大鼠與對照組之間的差別不具有統(tǒng)計學意義。MD組和MD9組的雌性大鼠比對照組的站立次數(shù)增多。但是MD組、MD4組、MD9組的雌性大鼠與對照組的其它參數(shù)間(開臂滯留時間、探頭次數(shù)和伸展次數(shù))的差別不明顯。
　　 9.在Morris水迷宮測試中，對照組的雌性大鼠在測試第一天的平均潛伏時間顯著高于雄性

15、大鼠的(p<0.05)，后4天沒有明顯差別。MD組的雌雄大鼠的平均潛伏時間沒有顯著差別(p>0.05)。對于雄性大鼠來說，MD組的平均潛伏時間在測試的第一天顯著高于對照組的(p<0.05)，在第5天極其顯著高于對照組的(p<0.01)，其余3天沒有明顯差別(p>0.05)。對于雌性大鼠來說，MD組的平均潛伏時間只在第5天極其顯著高于對照組的(p<0.01)，而其余4天沒有明顯差別(p>0.05)。
　　 10.在PND35，雌性

16、大鼠和雄性大鼠海馬的CALR水平有顯著差別(p<0.05)。對于雄性大鼠來說：經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測試的大鼠的海馬的CALR水平顯著低于只經(jīng)歷過母愛剝奪的大鼠的(p<0.05)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測試的大鼠的海馬的CALR水平顯著低于沒有經(jīng)歷任何應激的大鼠的(p<0.05)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測試的大鼠的海馬的CALR水平極其顯著低于只經(jīng)歷水迷宮測試的大鼠的(p<0.01)。對于雌性大鼠來說：只經(jīng)歷母愛剝奪的大鼠的海馬的CALR水平

17、顯著高于沒有經(jīng)歷任何應激的大鼠的(p<0.05)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測試的大鼠的海馬的CALR水平顯著高于只經(jīng)歷過母愛剝奪的大鼠的(p<0.05)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測試的大鼠的海馬的CALR水平極其顯著高于只經(jīng)歷水迷宮測試的大鼠的；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測試的大鼠的海馬的CALR水平極其顯著高于沒有經(jīng)歷任何應激的大鼠的(p<0.001)。
　　 11.在PND35，雌性大鼠和雄性大鼠海馬的CALB水平有極其顯著的差別(p<0

18、.001)。對于雄性大鼠來說：只經(jīng)歷水迷宮測試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于沒有經(jīng)歷任何應激的大鼠的(p<0.001)；只經(jīng)歷水迷宮測試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于只經(jīng)歷母愛剝奪的大鼠的(p<0.001)；只經(jīng)歷水迷宮測試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測試的大鼠的(p<0.001)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著低于沒有經(jīng)歷任何應激的大鼠的(p<0.001)；經(jīng)歷

19、母愛剝奪和水迷宮測試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著低于只經(jīng)歷母愛剝奪的大鼠的(p<0.001)。對于雌性大鼠來說：只經(jīng)歷水迷宮測試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于沒有經(jīng)歷任何應激的大鼠的(p<0.01)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于沒有經(jīng)歷任何應激的大鼠的(p<0.01)；只經(jīng)歷母愛剝奪的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于沒有經(jīng)歷任何應激的大鼠的(p<0.001)。
　　 結(jié)論：

20、r>　　 1.大鼠在新生期經(jīng)歷母愛剝奪(每日3h，PND2-PND14)，會影響成年后海馬的神經(jīng)發(fā)生及其功能，并且造成的結(jié)果與大鼠的性別有關(guān)。
　　 2.不同模式的母愛剝奪對大鼠海馬的GR、CALR和CALB的表達的作用不同，同時與大鼠的性別有關(guān)。
　　 3.早期經(jīng)歷母愛剝奪會對成年后雌雄大鼠的海馬的學習和記憶功能造成一定程度的損害，增加大鼠的焦慮性，降低它們的探索性。
　　 4.早期經(jīng)歷母愛剝奪會令雌性大鼠對