急性應(yīng)激對(duì)老齡鼠術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是指外科手術(shù)麻醉后發(fā)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，表現(xiàn)為患者術(shù)后出現(xiàn)意識(shí)、認(rèn)知、定向、思維、記憶以及睡眠等方面的紊亂?，F(xiàn)發(fā)病機(jī)制尚不明確，但與高齡，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)和應(yīng)激刺激均相關(guān)。臨床中急診手術(shù)的患者不占少數(shù)，他們?cè)谌朐航邮苁中g(shù)之前均受到外傷，車禍、劇烈疼痛等急性應(yīng)激刺激，這種情況對(duì)于手術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能會(huì)造成什么影響呢？越來越多的證據(jù)表明應(yīng)激刺激加重了機(jī)體對(duì)后續(xù)外周免疫應(yīng)激產(chǎn)生的促炎反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)的目的便

2、是探究急性應(yīng)激預(yù)刺激是否會(huì)加重術(shù)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)，延遲術(shù)后空間學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)并探尋其中機(jī)制。
　　研究方法:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（雄性老年SD大鼠共288只）隨機(jī)分為8組，分別為對(duì)照組(C)(n=60)、刺激組(IS)(n=60)、手術(shù)組(S)(n=36)、刺激+手術(shù)組(IS+S)(n=36)、皮質(zhì)酮組(CORT)(n=42)、皮質(zhì)酮+手術(shù)組（CORT+S）(n=18)、刺激+米非司酮組(IS+RU486)(n=18)、刺激+米

3、非司酮+手術(shù)組(IS+RU486+S)(n=18)。部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于手術(shù)前或刺激前連續(xù)6天進(jìn)行Morris水迷宮定向航行學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)。C組SD大鼠不做任何特殊處理。需要應(yīng)激刺激的實(shí)驗(yàn)鼠在進(jìn)行6天Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)后，于第7天進(jìn)行不可避免的尾刺激(inescapable tailshock，IS)。需要手術(shù)的實(shí)驗(yàn)鼠均于第8天（刺激后24小時(shí)）行肝部分切除術(shù)。CORT組和CORT+S組SD大鼠在連續(xù)6天進(jìn)行Morris水迷宮定向航行學(xué)

4、習(xí)實(shí)驗(yàn)后，第7天進(jìn)行皮下注射皮質(zhì)酮2.5mg/kg，需要手術(shù)的實(shí)驗(yàn)鼠于24小時(shí)后行肝部分切除術(shù)。IS+RU486組和IS+RU486+S組的SD大鼠在進(jìn)行6天Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)后，于第7天進(jìn)行不可避免的尾刺激，刺激后立刻雙下肢多點(diǎn)肌注米非司酮(RU486)30mg/kg，需要手術(shù)的實(shí)驗(yàn)鼠于24小時(shí)后行肝部分切除術(shù)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)后或刺激后第1、3、7天行翻轉(zhuǎn)水迷宮測(cè)試并處死獲得標(biāo)本。在各個(gè)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)我們檢測(cè)炎性因子IL-1

5、β和IL-6，膠質(zhì)細(xì)胞激活相關(guān)指標(biāo)Iba-1、GFAP和CD200，糖皮質(zhì)激素。
　　結(jié)果:第一部分:利用翻轉(zhuǎn)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來測(cè)驗(yàn)經(jīng)過手術(shù)或者應(yīng)激刺激處理后的老齡鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力。通過對(duì)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析我們得出以下結(jié)論，單獨(dú)接受應(yīng)激刺激的實(shí)驗(yàn)鼠跟C組的實(shí)驗(yàn)鼠相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比并沒有明顯的潛伏期延長(zhǎng)（圖2A，p＞0.05）。然而，S組的實(shí)驗(yàn)鼠和IS+S組的實(shí)驗(yàn)鼠均明顯損害了術(shù)后第1天和第3天的空間學(xué)習(xí)記憶能力。刺激復(fù)合手

6、術(shù)的實(shí)驗(yàn)刺激相對(duì)于單獨(dú)的手術(shù)刺激會(huì)導(dǎo)致術(shù)后第3天更為顯著的潛伏期延長(zhǎng)（圖2A，p＜0.05）。所有組的空間記憶能力均在術(shù)后第7天恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。各組在游泳速度方面均沒有明顯差異，提示部分實(shí)驗(yàn)鼠尋找平臺(tái)所需時(shí)間的延長(zhǎng)并不是由于實(shí)驗(yàn)鼠的體能差異而來。因此綜上所述，Morris水迷宮結(jié)果提示應(yīng)激刺激增強(qiáng)了手術(shù)刺激造成術(shù)后空間學(xué)習(xí)記憶能力的損害。
　　第二部分:我們?cè)谘芯考毙詰?yīng)激和手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)老齡鼠行為學(xué)變化的基礎(chǔ)上，用ELISA方法

7、進(jìn)一步定量檢測(cè)老齡鼠海馬區(qū)炎性因子IL-1β和IL-6含量的變化。利用雙因素方差分析海馬區(qū)炎性因子表達(dá)顯示，單獨(dú)給予急性應(yīng)激預(yù)刺激在術(shù)后第1、3和7天均沒有導(dǎo)致海馬區(qū)IL-1β的升高（圖3A，p＞0.05）。S組實(shí)驗(yàn)鼠和IS+S組實(shí)驗(yàn)鼠IL-1β在術(shù)后第1天和第3天表達(dá)均比對(duì)照組明顯增高（圖3A，p＜0.01）。并且于術(shù)后第3天，我們觀察到IS+S組實(shí)驗(yàn)鼠的IL-1β明顯高于S組的實(shí)驗(yàn)鼠(圖3A，p＜0.05)，這就證明了提前接受急性應(yīng)

8、激刺激可以增強(qiáng)后續(xù)手術(shù)導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。所有升高的促炎因子于術(shù)后第7天回歸到術(shù)前的基線水平。在IL-6的表達(dá)變化上我們發(fā)現(xiàn)了與IL-1β同樣的趨勢(shì)（圖3B，p＜0.01）。
　　我們利用免疫熒光的方法檢測(cè)Iba-1，以探究小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況。急性應(yīng)激刺激后24小時(shí)，IS組實(shí)驗(yàn)鼠的Iba-1表達(dá)水平明顯比C組實(shí)驗(yàn)鼠的Iba-1增高(圖4A，A'，B，B'，E，p＜0.05)。S組和IS+S組實(shí)驗(yàn)鼠在術(shù)后第1天，Iba-1的表達(dá)水平均

9、明顯上升（圖4E，p＜0.01，p＜0.01）。除此之外，我們還觀察到在接受手術(shù)之間提前接受急性刺激的實(shí)驗(yàn)鼠的Iba-1表達(dá)水平在術(shù)后第3天出現(xiàn)明顯的額外升高（圖4C，C'，D，D'，E，p＜0.01），這就證明了急性應(yīng)激刺激和手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞的激活上起著明顯的協(xié)同作用。所有實(shí)驗(yàn)鼠的Iba-1水平在術(shù)后第7天均回到了基線水平。為了探究應(yīng)激刺激導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活的潛在機(jī)制，我們還利用Real-time PCR的方法檢測(cè)CD200(c

10、luster of differentiation200)含量的變化。我們檢測(cè)到跟C組相比，IS組實(shí)驗(yàn)鼠的CD200mRNA的表達(dá)水平在刺激后24小時(shí)明顯下調(diào)（圖5，p＜0.05）。術(shù)后第1天，我們發(fā)現(xiàn)無論實(shí)驗(yàn)鼠提前是否接受了急性應(yīng)激刺激，手術(shù)創(chuàng)傷均明顯下調(diào)了腦內(nèi)海馬區(qū)CD200的表達(dá)（圖5，p＜0.01，p＜0.01），并且這種下降在術(shù)后第7天均恢復(fù)至正常水平。除此之外，我們觀察到在術(shù)后第3天，跟S組的實(shí)驗(yàn)鼠相比，應(yīng)激刺激和手術(shù)創(chuàng)傷的

11、結(jié)合嚴(yán)重的導(dǎo)致了CD200表達(dá)的降低（圖5，p＜0.01）。
　　我們利用免疫熒光的方法來檢測(cè)GFAP，以探究星形膠質(zhì)細(xì)胞在受到手術(shù)創(chuàng)傷和應(yīng)激刺激時(shí)是否會(huì)被激活。免疫熒光的結(jié)果顯示，應(yīng)激刺激后24小時(shí)，相對(duì)于C組相比，IS組GFAP的表達(dá)并沒有因?yàn)榻邮芰藨?yīng)激刺激而增加(圖6A，A'，B，B'，G，p＞0.05)。盡管S組和IS+S組的實(shí)驗(yàn)鼠GFAP的表達(dá)在術(shù)后第1天和術(shù)后第3天均明顯上升（圖6C，C'，D，D'，E，E'，F(xiàn)，F(xiàn)'

12、，G，p＜0.01），但是跟S組的實(shí)驗(yàn)鼠相比，提前接受了應(yīng)激刺激的實(shí)驗(yàn)鼠在任何時(shí)間點(diǎn)的GFAP表達(dá)都并沒有比單獨(dú)手術(shù)的實(shí)驗(yàn)鼠增高（圖6G，p＞0.05）。
　　第三部分:我們將C組、IS組和CORT組實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行了刺激前、刺激后24h、48h和72h外周取血，利用ELISA檢測(cè)刺激前后皮質(zhì)酮的變化。我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)鼠在接受刺激后，其體內(nèi)皮質(zhì)酮的含量與對(duì)照組相比明顯上升（圖7，p＜0.01和p＜0.05）。體內(nèi)皮質(zhì)酮的濃度在刺激后24小時(shí)

13、最高，隨后的48小時(shí)逐漸下降，于刺激后72小時(shí)回落至基線水平。而給予皮下注射CORT的實(shí)驗(yàn)鼠，其體內(nèi)皮質(zhì)酮的變化與IS組實(shí)驗(yàn)鼠相同。
　　我們發(fā)現(xiàn)IS+RU486組和CORT組均與C組和IS組相類似，并沒有使刺激后海馬區(qū)的炎性因子IL-1β（圖8A，p＞0.05）和IL-6（圖8B，p＞0.05）表達(dá)上調(diào)。IS+RU486+S組實(shí)驗(yàn)鼠同S組實(shí)驗(yàn)鼠類似，在術(shù)后第1天和第3天其海馬區(qū)炎性因子IL-1β和IL-6水平均明顯上調(diào)，術(shù)后第7

14、天下降至正常水平（圖9A、B，p＜0.01）。CORT+S組同IS+S組類似，不僅術(shù)后第1天和第3天炎性因子水平上升至第7天回落，我們還發(fā)現(xiàn)IS+RU486+S組與IS+S組相比，在術(shù)后第3天炎性因子水平明顯下降（圖9A、B，p＜0.01）;S組與CORT+S組相比，其術(shù)后第3天炎性因子的表達(dá)水平也明顯下降（圖9A、B，p＜0.01）。
　　利用翻轉(zhuǎn)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)以測(cè)驗(yàn)各組實(shí)驗(yàn)鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力。我們?cè)趹?yīng)激刺激后立刻肌注

15、糖皮質(zhì)激素受體阻滯劑(RU486)的實(shí)驗(yàn)鼠，即IS+RU486組實(shí)驗(yàn)鼠在尋找水池中平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間與C組實(shí)驗(yàn)鼠沒有明顯差異（圖11A，p＞0.05），同樣的現(xiàn)象我們也發(fā)現(xiàn)在CORT組實(shí)驗(yàn)鼠（圖11A，p＞0.05）。IS+RU486+S組實(shí)驗(yàn)鼠同S組實(shí)驗(yàn)鼠類似，在術(shù)后第1天和第3天其空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損，潛伏期明顯延長(zhǎng)。CORT+S組同IS+S組類似，不僅術(shù)后第1天和第3天潛伏期明顯延長(zhǎng)，我們還發(fā)現(xiàn)IS+S組與IS+RU486+S組

16、相比，在術(shù)后第3天潛伏期增加(圖12A，p＜0.01);CORT+S組與S組相比，其術(shù)后第3天潛伏期也明顯增加（圖12B，p＜0.05）。
　　結(jié)論:1.急性應(yīng)激預(yù)刺激延遲了老齡鼠術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)。
　　2.急性應(yīng)激預(yù)刺激可引起老齡鼠術(shù)后腦內(nèi)海馬區(qū)炎性因子（IL-1β和IL-6）表達(dá)增加，小膠質(zhì)細(xì)胞激活增加。
　　3.急性應(yīng)激刺激可引起老齡鼠刺激后24小時(shí)腦內(nèi)海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活增加，對(duì)海馬區(qū)炎性因子表達(dá)和學(xué)習(xí)記