proBDNF對(duì)老齡鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是老年人群癡呆的主要類型，已經(jīng)成為危害老年人群健康和生命的重要疾病。目前全球有AD患者約1200萬人，隨著人口老齡化問題的加劇，預(yù)計(jì)到2050年全球?qū)⒐灿蠥D患者4500萬。AD的患者給家庭和社會(huì)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 我國人口老齡化問題尤為嚴(yán)峻。我國已于1999年進(jìn)入老齡社會(huì)，是較早進(jìn)入老齡社會(huì)的發(fā)展中國家之一，也是世界上老年人口最多的國家。21世紀(jì)

2、的中國將是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的老齡社會(huì)。按目前AD的發(fā)病率推算，到2050年我國將有AD患者800萬-1200萬。AD將成為我國的一個(gè)嚴(yán)峻的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，對(duì)AD的防治非常緊迫。 AD海馬的病理變化之一是海馬神經(jīng)元的缺失，研究如何防止神經(jīng)元丟失以及補(bǔ)充缺失的神經(jīng)元成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物海馬齒狀回顆粒層下區(qū)終生存在著神經(jīng)發(fā)生的能力，但成年動(dòng)物這種自發(fā)的神經(jīng)發(fā)生是有限的，而且隨著年齡增長逐漸下降，海馬神經(jīng)發(fā)生的

3、下降與老年認(rèn)知功能損害相關(guān)。因此，研究如何促進(jìn)老齡海馬神經(jīng)元的增殖、存活及功能聯(lián)系有望為AD的防治提供新的策略。 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derivedneurothrophicfactor，BDNF)通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和存活而影響神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生，BDNF還與活動(dòng)依賴性突觸可塑性有關(guān)，對(duì)改善認(rèn)知功能有重要作用。BDNF由其前體物質(zhì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體(precursorofbrainderivedneurotr

4、ophicfactor，proBDNF)在胞外裂解而成。最近研究表明，proBDNF是BDNF基因表達(dá)產(chǎn)物在胞外的主要存在形式之一，proBDNF與BDNF共同廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括海馬；未裂解的proBDNF本身可能有著與BDNF作用相反的功能；proBDNF第66個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異后，BDNF分泌受限，海馬的功能受到抑制，學(xué)習(xí)記憶能力下降；病理情況下，如AD，P75NTR表達(dá)升高，proBDNF與之結(jié)合后能夠促進(jìn)海馬長時(shí)程抑

5、制；老年以及AD早期動(dòng)物的腦內(nèi)BDNFmRNA表達(dá)增加，proBDNF蛋白含量增加。這些研究結(jié)果提示，proBDNF在認(rèn)知功能障礙發(fā)生、發(fā)展過程中可能有著重要作用。 進(jìn)一步認(rèn)識(shí)proBDNF在老齡海馬神經(jīng)發(fā)生以及突觸可塑性中的作用，對(duì)于AD的預(yù)防有重要意義。為此，本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容包括：基因重組抗裂解proBDNF蛋白的表達(dá)、純化、鑒定及生物學(xué)活性測定；探討proBDNF對(duì)老齡鼠認(rèn)知功能的影響；通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)從海馬神經(jīng)發(fā)生及突觸可

6、塑性變化角度探討proBDNF對(duì)老齡鼠認(rèn)知功能影響的機(jī)制。 方法： 1.基因重組proBDN_F蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及活性鑒定 以大鼠點(diǎn)突變型基因的全長proBDNFcDNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增proBDNF的cDNA，應(yīng)用基因重組技術(shù)將大鼠proBDNFcDNA克隆到質(zhì)粒pET-28a中，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA測序鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，用Ni-NTA親和層析

7、純化獲取蛋白，用SDS-PAGE和westernblot方法鑒別，DAPI法檢測重組蛋白對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響。 2.proBDNF對(duì)老齡鼠認(rèn)知功能影響 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用18月齡C57BL/6J鼠，隨機(jī)分為三組：proBDNF組、抗proBDNF組和對(duì)照組，每組10只，分別采用微量滲透泵連續(xù)6天向右側(cè)海馬注射proBDNF、羊抗proBDNF或BSA，濃度均為1μg/μ1,速度0.2μ1/h。術(shù)后21天，采用Morris水

8、迷宮進(jìn)行航行定位實(shí)驗(yàn)測定老齡鼠的平均逃避潛伏期、游泳速度，并進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)測定動(dòng)物在月臺(tái)所在象限時(shí)間的百分比。 3.proBDNF對(duì)老齡鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用18月齡C57BL/6J鼠，隨機(jī)分為三組：proBDNF組，抗proBDNF組及對(duì)照組，每組lO只，分別采用微量滲透泵連續(xù)6天向右側(cè)海馬注射BSA、proBDNF或羊抗proBDNF，濃度均為1μg/μ1，速度0.2μ1/h。動(dòng)物術(shù)后當(dāng)日始給予BrdU

9、50mg/kg.體重，腹腔注射，每日2次，持續(xù)6天。分別于術(shù)后7天、28天檢測海馬細(xì)胞增殖情況，并利用免疫熒光三標(biāo)法對(duì)Brdu陽性細(xì)胞進(jìn)行鑒定； 4.proBDNF對(duì)老齡鼠海馬突觸可塑性的影響 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用18月齡C57BL/6J鼠，隨機(jī)分為三組：proBDNF組，抗proBDNF組及對(duì)照組，每組5只，分別采用微量滲透泵連續(xù)6天向右側(cè)海馬注射BSA、proBDNF或羊抗proBDNF，濃度均為1μg/μ1，速度0.2μ1

10、/h。術(shù)后28天使用免疫印跡分析方法檢測海馬synapsinⅠ和pCREB的變化。 5.proBDNF對(duì)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元增殖和凋亡的影響采 用出生24小時(shí)的雌性P75NTR基因敲除鼠以及野生型鼠海馬建立海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，分別采用含proBDNF(10ng/ml)，proBDNF(10ng/ml)+sortilin-FC(20ng/ml)，或BSA(10ng/ml)的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，采用BrdU標(biāo)記法觀察海馬神經(jīng)元增

11、殖情況，用TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞。 結(jié)果： 1.基因重組proBDNF蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及活性鑒定 擴(kuò)增出的大鼠proBDNFcDNA片段克隆進(jìn)了原核表達(dá)載體，經(jīng)酶切和核酸測序鑒定，得到了正確的重組質(zhì)粒pET-proBDNF，并在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。純化后的蛋白經(jīng)考馬氏亮藍(lán)染色呈單一條帶，用抗proBDNF的抗體進(jìn)行westernblot分析證明目的蛋白獲得了表達(dá)。免疫組化結(jié)果提示，基因重組proBDNF

12、蛋白能夠促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡，而親合純化的羊抗proBDNF抗體能夠中和proBDNF的促細(xì)胞凋亡作用。 2.proBDNF對(duì)老齡鼠認(rèn)知功能影響 Morris水迷宮測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)第3天起，proBDNF注射組平均逃避潛伏期明顯長于對(duì)照組；而抗proBDNF組平均逃避潛伏期比對(duì)照組短。各組之間游泳速度相差不顯著。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，proBDNF組在平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間的百分比明顯比對(duì)照組小，動(dòng)物

13、入水后無目的游動(dòng)，而抗proBDNF組在平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間的百分比明顯比對(duì)照組增加，其運(yùn)動(dòng)軌跡主要集中于原平臺(tái)所在位置。 3.proBDNF對(duì)老齡鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響 免疫組化結(jié)果顯示，術(shù)后第7天，典型的BrdU陽性細(xì)胞內(nèi)有深棕黃色的顆粒，這些陽性細(xì)胞大部分位于顆粒細(xì)胞層與門區(qū)之間，即所謂的下顆粒區(qū)，往往緊密排列、成簇出現(xiàn)，細(xì)胞形狀不規(guī)則。術(shù)后第28天，BrdU陽性細(xì)胞呈橢圓型或圓形，形態(tài)接近顆粒細(xì)胞，多數(shù)位于顆粒細(xì)胞

14、層，也有零星細(xì)胞位于海馬門區(qū)。 術(shù)后第7天及第28天proBDNF組每張切片BrdU陽性細(xì)胞數(shù)均分別明顯低于BSA對(duì)照組(p＜0.01)，而抗proBDNF組則明顯高于BSA對(duì)照組(p＜0.01)。術(shù)后第28天，proBDNF組、抗proBDNF組及對(duì)照組，各組中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)與術(shù)后第7天同組比較均明顯下降(其中proBDNF組下降最明顯)，分別為術(shù)后第7天的50％、38％和60％。 免疫熒光三標(biāo)法對(duì)術(shù)后第7天和第2

15、8天BrdU陽性細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)proBDNF組、抗proBDNF組以及BSA組，三組中各細(xì)胞類型的百分比無顯著性差異。 4.proBDNF對(duì)老齡鼠海馬突觸可塑性的影響 術(shù)后第28天免疫印跡結(jié)果顯示，proBDNF組海馬synapsinⅠ以及pCREB的含量分別較BSA對(duì)照組明顯減少(p＜0.01)，而抗proBDNF組海馬synapsinⅠ以及pCREB的含量則明顯增加(p＜0.01)。 5.proBDN

16、F對(duì)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元增殖和凋亡的影響 對(duì)于野生型鼠培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，與對(duì)照組比較，proBDNF組BrdU陽性細(xì)胞百分比明顯降低(p＜0.01)、TUNEL陽性細(xì)胞百分比明顯增加(p＜0.01)，而proBDNF+sortilin-FC組BrdU陽性細(xì)胞百分比、TUNEL陽性細(xì)胞百分比與對(duì)照組比較無顯著差異。 P75NTR基因敲除鼠培養(yǎng)神經(jīng)元中，proBDNF組BrdU陽性細(xì)胞百分比、TUNEL陽性細(xì)胞百分比與對(duì)照組比較無

17、顯著差異。 結(jié)論： 1.本研究成功構(gòu)建了表達(dá)基因重組大鼠proBDNF的原核表達(dá)載體，基因重組大鼠proBDNF蛋白在大腸桿菌中獲得了表達(dá)和純化，所獲得的基因重組蛋白具有較好的生物學(xué)活性。 2.通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，證實(shí)proBDNF能夠降低老齡鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，而阻斷內(nèi)源性proBDNF后能改善老齡鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。 3.proBDNF可抑制海馬細(xì)胞增殖、降低新生細(xì)胞的存活率，但對(duì)細(xì)胞分化無影響。