IL-1對老齡小鼠術后認知功能的影響及機制研究.pdf

1、前言：
　　術后認知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)作為臨床手術病人術后重要的并發(fā)癥，將會嚴重影響老年患者的生活質(zhì)量。術后認知功能障礙多發(fā)生于老年患者，但是確切的機制是未知的而且圍術期眾多因素混雜其中。
　　許多研究已經(jīng)將焦點集中于外科手術這個初始條件。我們的實驗室和許多研究已經(jīng)證明老年鼠手術后腦海馬區(qū)炎性反應的刺激導致大量因子釋放，例如IL-1β、IL-6、TNF

2、-α等過度表達。AD病人海馬區(qū)炎性因子也被大量觀察到，而Aβ的過度表達、凝聚，更是AD患者發(fā)病機理的核心。
　　實際上有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AD病人與對照組比較細胞炎性因子水平增加。另外，AD病人大腦中星形膠質(zhì)細胞激活也導致Aβ沉積。這樣就推測POCD和AD可能存在相似的病理生理機制。早期研究已經(jīng)證明炎性因子在外科病人術后認知下降中扮演重要角色。然而，AD病人相關路徑的分子機制和海馬區(qū)炎性因子的關系是不好理解的。以前研究已經(jīng)證明TGF-β

3、（一種在AD病人腦內(nèi)過表達的細胞因子）無論體內(nèi)實驗還是體外實驗均誘導APP堆積，促進Aβ形成，通過Smad3信號通路激活星形膠質(zhì)細胞。但是缺乏直接的證據(jù)來證明而僅僅是推斷POCD時TGF-β/Smad信號通路可能發(fā)生重要作用。
　　本研究擬通過描述一種新的由Th17細胞產(chǎn)生的細胞炎性因子IL-17A，發(fā)現(xiàn)其在粘膜免疫、組織炎性反應、自身免疫反應等方面扮演的關鍵角色。我們阻斷了老年小鼠肝部分切除術后IL-17A/IL-17R來評估P

4、OCD中IL-17的作用。我們假設外科手術刺激誘導IL-17釋放伴隨顯著的海馬區(qū)炎癥反應和記憶損傷。本研究的目標有兩個:一，確定IL-17觸發(fā)老年肝部分切除術小鼠海馬區(qū)炎癥反應。二，TGF-β/Smad信號通路對這些神經(jīng)病理學和生化改變有貢獻。
　　材料與方法：
　　14-20月齡雄性C57BL/6小鼠，體重30-40g。飼養(yǎng)在室溫23°、濕度恒定、燈光12小時晝夜輪換房間，自由進食及飲水。
　　實驗一:小鼠隨機分為對

5、照組（C組），假手術組（A組）、手術組（SA組）、單克隆抗體組（SI組）、IgG組（SC組）。單克隆抗體組（SI組）和IgG組(SC組)于常規(guī)水迷宮訓練前3天進行側(cè)腦室置管。所有五組均在術前5天進行常規(guī)水迷宮訓練。對照組（C組）不作任何處理。假手術組（A組）實驗動物術前12小時禁食，自由飲水，0.6％戊巴比妥鈉（50mg/kg體重）腹腔注射麻醉，不進行手術操作。手術組（SA組）實驗動物戊巴比妥鈉麻醉后行肝部分切除術。單克隆抗體組（SI組

6、）（肝切除術同時）側(cè)腦室注射IL-17單克隆抗體4μg。IgG組(SC組)注射兔抗鼠IgG2a（肝切除術同時）。
　　所有五組均在術后7天進行常規(guī)水迷宮訓練，術后1、3、7天進行空間探索試驗，時間限定90s。C組A組SA組于術后24h、72h、7d水迷宮測試后各處死小鼠，單克隆抗體組（SI組）及IgG組（SC組）術后72h水迷宮測試后處死2/3小鼠，取海馬組織，-70℃保存，等待RNA(mRNA)檢測及Western blot檢測

7、。
　　實驗二:C57BL/6小鼠星形膠質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)，培養(yǎng)2周后將少突膠質(zhì)細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞從星形膠質(zhì)細胞中機械分離出去。免疫熒光檢測GFAP(膠原原纖維酸性蛋白)的表達鑒定星形膠質(zhì)細胞。分為四組:
　　1）對照組，沒有干預;
　　2）IL-17組，給于IL-17;
　　3）陽性對照組，給于IgG2a;
　　4)干預組，先加入IL-17RA-siRNA轉(zhuǎn)染細胞24h，再加入IL-17。分別于培養(yǎng)1h、

8、24h和48h收集細胞，Real-time PCR及Western blot檢測IL-17A、IL-6、TGFβ、Smad2/3、APP和Aβ的表達。
　　分為兩組，分別加入IL-17A及IL-17A+TGFβⅠ型受體選擇性抑制劑TβRI(5uM)，于培養(yǎng)24h收集細胞。Real-timePCR及Western blot檢測TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3、APP、Aβ的表達。
　　統(tǒng)計方法：
　

9、　數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。同組間參數(shù)分析利用t檢驗，不同組間參數(shù)比較利用單因素或多因素方差分析，后繼Dunnett t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　研究結(jié)果：
　　實驗一:各組實驗小鼠術前訓練后認知功能上升，對照組及單純麻醉組實驗小鼠術日后認知功能無改變。手術創(chuàng)傷組的老年小鼠術后發(fā)生認知功能損害，以第三天為高峰，七天恢復。手術創(chuàng)傷組海馬區(qū)IL-17A

10、表達在術后第一天顯著增加，術后第三天的星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP表達增多.同時，術后三天時TGF-β、Smad、APP和Aβ等表達顯著增加，維持高水平至術后第七天。IL-17單克隆抗體組的IL-17蛋白表達顯著減少，APP、pSmad蛋白表達相應減少。
　　實驗二:IL-17A組TGF-β、Smad1h即表達，24h達到高峰，48h小時輕微衰減。IL-17RAsiRNA組各個時點TGF-β、Smad表達均受抑制。IL-17A組顯著

11、上調(diào)APP、Aβ等的mRNA及蛋白表達，而IL-17RA siRNA組則相反。加入TGF-βRI組（TGF-β抑制劑）和IL-17A組比較抑制了TGF-β、pSmad、Aβ等的表達水平。
　　結(jié)論：
　　1、老年C57BL/6小鼠肝部分切除術為模型觸發(fā)的一系列的神經(jīng)認知功能下降是和IL-17誘導的神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化、持續(xù)Aβ產(chǎn)生、海馬TGF-β/Smad途徑相關的。
　　2、阻斷IL-17炎癥因子或者阻斷TGF-β/Sm