基因芯片載體的表面化學(xué)處理及核酸固定技術(shù)研究.pdf

1、核酸固定技術(shù)是涉及到表面化學(xué)、分子生物學(xué)的交叉學(xué)科，主要包括物理吸附和化學(xué)偶聯(lián)(共價連接)兩大類。在傳統(tǒng)的固定技術(shù)中多以物理吸附為主要方式，存在著表面活性差、連接效率低、穩(wěn)定性差等缺陷。該研究將共價連接方法引入玻片的表面處理和核酸的固定中：改進(jìn)了經(jīng)典的多聚賴氨酸(poly-L-lysine)包被法；自行研制研究了兩種基于多組分多氨基化合物連接系統(tǒng)和丙烯酸-丙烯酰胺聚合物系統(tǒng)的芯片表面；將它們應(yīng)用于λ噬菌體全基因組基因芯片和SARS-Co

2、V冠狀病毒寡核苷酸芯片的制備與檢測；利用陣列引物延伸技術(shù)將優(yōu)化的芯片表面用于p53基因的SNP檢測。 研究包括以下過程： 1.多聚賴氨酸偶聯(lián)的優(yōu)化 在原有poly-L-lysine表面處理基礎(chǔ)上，在玻片表面偶聯(lián)上多聚賴氨酸聚合物分子層。這些聚合物涂層以共價鍵連接在玻片表面，經(jīng)PDITC交聯(lián)劑活化后，能將寡核苷酸以共價鍵結(jié)合的形式固定在玻片上。在此表面制備了寡核苷酸芯片，檢測其固定效率、雜交效率、重復(fù)利用性和穩(wěn)定性

3、等重要指標(biāo)，結(jié)果表明各項性能均優(yōu)于傳統(tǒng)的poly-L-lysine芯片表面。 2.網(wǎng)狀聚合物分子層的表面修飾 為了克服玻片平整致密的表面結(jié)構(gòu)使其探針上樣量有限、生物分子連接效率差的缺點，研制研究了兩種不同的方案對玻片進(jìn)行表面化學(xué)處理，一種是在玻片表面衍生樹狀分支的多組分多氨基化合物連接系統(tǒng)(Poly-Amine表面)，另一種是在玻片表面聚合上具有溶脹性的網(wǎng)格狀聚合物分子層丙烯酸-丙烯酰胺聚合物系統(tǒng)(AACA-Copoly

4、mer表面)。利用表面化學(xué)反應(yīng)將富含氨基的化合物或聚合物以共價鍵方式連接到預(yù)先硅烷化的顯微載玻片上，然后利用官能團(tuán)交聯(lián)分子活化玻片表面，使DNA能快速、穩(wěn)定地結(jié)合在玻片上。通過對固定效率的檢測獲得了兩種芯片表面上最適合的固定探針濃度、長度和種類。雜交點陣的熒光信號強度高、背景低，雜交點圓潤、同一性好，適合不同長度的未修飾寡核苷酸芯片的制備，其中AACA-Copolymer玻片的制備流程更簡單。 3.DNA芯片和Oligo芯片的檢

5、驗研究 將所研制的兩種玻片進(jìn)一步應(yīng)用于DNA芯片和寡核苷酸芯片的制備與檢測，并在雜交過程中采用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)來進(jìn)行檢測，考察其通用性。 1)將研制的Poly-Amine和AACA-Copolymer表面用于λ噬菌體全基因組芯片的制備：采用了PCR擴增法收集實驗所需的探針，制備λ噬菌體全基因組芯片，用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)對λ噬菌體全基因組待測樣品進(jìn)行標(biāo)記、雜交和檢測。 2)按照寡核苷酸探針設(shè)計原則，設(shè)計并合成了1

6、2條60mer的SARS-CoV寡核苷酸，并將其固定在所研制的玻片上，制備了SARS冠狀病毒寡核苷酸芯片，利用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)對VeoE6細(xì)胞培養(yǎng)的SARS-CoV樣品標(biāo)記后與芯片雜交、檢測。實際應(yīng)用表明，Poly-Amine玻片和AACA-Copolymer玻片在芯片制作中通用性好，探針固定效率高，檢測靈敏性好。同時與Corning公司和Telechem公司的商業(yè)化芯片表面進(jìn)行了比較，進(jìn)一步證實了所研制芯片表面的性能。 4.

7、SNPsp53芯片的原位延伸技術(shù)研究 在研制的優(yōu)化AACA-Copolymer玻片上，以K562細(xì)胞為研究對象，應(yīng)用寡核苷酸陣列引物延伸法對p53基因進(jìn)行SNPs的平行檢測。根據(jù)寡核苷酸基因芯片上延伸引物的設(shè)計原則設(shè)計出12條p53基因第三外顯子上的SNP檢測的延伸引物，點樣制備成寡核苷酸基因芯片，將巢式PCR擴增出的p53基因片段與芯片雜交，在DNA聚合酶(KlenowFragment)的介導(dǎo)下進(jìn)行熒光標(biāo)記的單堿基延伸反應(yīng)、洗

8、脫、掃描。同時p53基因片段進(jìn)行測序分析。經(jīng)熒光檢測分析，芯片經(jīng)延伸反應(yīng)后出現(xiàn)了明顯的Cy3-dUTP或Cy5-dCTP熒光標(biāo)記信號，檢測靈敏度好，結(jié)果與測序驗證結(jié)果一致。此方法可以在基因水平實現(xiàn)對p53基因的多個位點的高靈敏度平行檢測，是一種高效、價廉、準(zhǔn)確的SNP檢測方法，為實現(xiàn)大規(guī)模基因突變檢測奠定了基礎(chǔ)。 有效的核酸固定技術(shù)是基因芯片制作中關(guān)鍵技術(shù)之一，也是基因芯片大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的前提條件。該文重點研究了基于共價連接的