腸梗阻導致腸功能障礙的中西醫(yī)結(jié)合實驗研究Ⅱ.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：腸梗阻導致腸功能障礙中腸上皮、腸免疫屏障及微生態(tài)的時相性研究 實驗一:家兔可復性腸梗阻造模方式及材料的改良 目的：在前期實驗建立的家兔機械性腸梗阻的基礎上進行梗阻方式和材料的改良，使模型操作更簡便、更經(jīng)濟、效果更穩(wěn)定。 方法：改用“腸管外壓迫”的方式，將輸液器部件改造成體外牽拉式鎖扣，在末段回腸腸系膜無血管區(qū)戳孔，套住腸管，引出切口旁腹壁外。手術1～2天后由體外牽拉鎖扣固定，

2、造成該部位腸管的閉塞梗阻。解除梗阻時只需剪斷鎖扣后抽出裝置。同時對體外水囊充注式梗阻裝置、塑封鋼纜圈套器等方法也進行了嘗試。 結(jié)果：該方法在造成梗阻的安全性、確切性等方面較原模型更優(yōu)，避免了原方法所存在的腹腔感染、腸粘連、腸套疊以及腸穿孔等意外情況，并且不存在裝置脫落等不穩(wěn)定因素。 結(jié)論：在獲得更確切穩(wěn)定的梗阻效果的基礎上，改良后的方法創(chuàng)傷更小、造模周期更短，操作簡單且材料經(jīng)濟，是較為理想的可復性機械性完全性腸梗阻模型。

3、 實驗二:腸梗阻對小腸上皮細胞的損害及其增殖修復能力的影響 目的：觀察急性機械性低位小腸梗阻對于小腸上皮損害程度以及其自身再增殖、修復能力的影響。 方法：選用健康大耳白兔，隨機分為正常對照組（Norm）、假手術組（Sham）、梗阻1h組（H1）、梗阻6h組（H6）、梗阻12h組（H12）、梗阻24h組（H24）、梗阻48h組（H48）、梗阻72h組（H72），每組6只。分別對各組動物血清瓜氨酸水平、生化、小腸組織

4、鳥氨酸脫羧酶活性，以及小腸上皮內(nèi)杯狀細胞形態(tài)、數(shù)量變化進行檢測和觀察。 結(jié)果：腸梗阻后早期腸上皮細胞存在保護性的增殖加速過程，表現(xiàn)為ODC活性在梗阻后6h開始增高（p<0.001），隨著梗阻未解除，損害因素不斷加重，ODC活性在梗阻24h下降，至72h甚至低于正常水平。對小腸上皮形態(tài)學觀察中發(fā)現(xiàn)杯狀細胞增多趨勢，且形態(tài)發(fā)生時相性改變。以上指標在小腸不同部位發(fā)生變化的時相和程度并不一致，回腸較之空腸變化更顯著。至梗阻48h-72h

5、階段，血清瓜氨酸水平低于正常水平（p<0.05）。另外在對生化指標的檢測中發(fā)現(xiàn)CK發(fā)生顯著變化較早，相對其它指標較為敏感（24h vs48h-72h）。 結(jié)論：①腸梗阻發(fā)生后的早期就已經(jīng)存在上皮的修復，表現(xiàn)為小腸組織ODC活性增高：②另外杯狀細胞可能參與了小腸粘膜的修復，并且可能是上皮修復的關鍵細胞；③在梗阻后期隨著上皮增殖活性的降低，血清瓜氨酸水平這一間接指標也隨之降低，說明其對判斷小腸功能障礙嚴重程度具有一定參考價值；④在腸

6、梗阻發(fā)生后，CK相對其他生化指標可能對腸實質(zhì)性損害更具有敏感的診斷提示意義。 實驗三:小腸梗阻后腸腔內(nèi)環(huán)境及微生態(tài)變化 目的：觀察急性機械性低位小腸梗阻發(fā)生后腸道內(nèi)環(huán)境及微生態(tài)的改變，以了解腸梗阻發(fā)生后腸道自穩(wěn)態(tài)破壞與腸屏障破壞的時相性關系。 方法：選用健康大耳白兔，隨機分為正常對照組（Norm）、假手術組（Sham）、梗阻1h組（H1）、梗阻6h組（H6）、梗阻12h組（H12）、梗阻24h組（H24）、梗阻4

7、8h組（H48）、梗阻72h組（H72），每組6只。觀察梗阻后每一時段小腸內(nèi)PH、含水量及采用平板計數(shù)法了解腸桿菌科與雙歧桿菌菌群數(shù)量變化。另外在不同時段進行血內(nèi)毒素水平、各臟器細菌移位陽性率等進行觀察。 結(jié)論：腸梗阻后腸功能障礙是對方面因素的綜合結(jié)果，其中腸道自穩(wěn)態(tài)的破壞為之后的細菌大量增殖、細菌和內(nèi)毒素移位提供了環(huán)境基礎。腸梗阻較早期的12h-24h階段可能是腸內(nèi)環(huán)境、微生態(tài)發(fā)生劇烈轉(zhuǎn)變的階段，同時也可能是細菌和內(nèi)毒素移位的

8、開始。而此時腸道機械屏障往往并沒有出現(xiàn)廣泛破壞，這更說明機械屏障、生物屏障、化學屏障的破壞都是腸功能障礙的危險因素。 實驗四:腸梗阻對腸上皮Claudin1 mRNA表達的影響 目的：了解急性腸梗阻發(fā)生后腸道上皮細胞間緊密連接破壞的時相性特點。 方法：選用健康大耳白兔，隨機分為正常對照組（Norm）、假手術組（Sham）、梗阻1h組（H1）、梗阻6h組（H6）、梗阻12h組（H12）、梗阻24h組（H24）、梗阻

9、48h組（H48）、梗阻72h組（H72），每組6只。利用實時熒光定量RT-PCR技術，對動物末段小腸上皮的緊密連接相關蛋白Claudin1的mRNA表達情況進行相對定量分析。 結(jié)論：腸梗阻發(fā)生后早期（6h）已經(jīng)發(fā)生機械屏障的破壞，表現(xiàn)為緊密連接蛋白上游基因的低表達，隨著梗阻進展，這種低表達更加顯著，至梗阻48h-72h階段，這一基因的表達水平已經(jīng)很低。提示這一階段腸上皮的完整性已經(jīng)完全失去，腸道機械屏障破壞嚴重。 實驗

10、五:腸梗阻家兔小腸免疫屏障功能的變化 目的：利用腸梗阻模型，觀察急性機械性腸梗阻的發(fā)生對腸道免疫系統(tǒng)的影響。 方法：選用健康大耳白兔，隨機分為正常對照組（Norm）、假手術組（Sham）、梗阻1h組（H1）、梗阻6h組（H6）、梗阻12h組（H12）、梗阻24h組（H24）、梗阻48h組（H48）、梗阻72h組（H72），每組6只。采用流式細胞術對梗阻近端低位回腸、高位空腸兩個不同部位小腸派伊爾淋巴結(jié)（PP）的CD3+、

11、CD4+、CD8+淋巴細胞亞群進行分析，利用HE染色切片計數(shù)上述兩個不同部位IEL和LPL的百分比于梗阻不同階段的變化。另外ELISA法檢測小腸內(nèi)分泌型免疫球蛋白A（S-IgA）含量。 結(jié)論：①腸梗阻發(fā)生后，小腸PP數(shù)量和總面積均增加，這可能與梗阻后受到更多炎性因素刺激有關，另外其內(nèi)淋巴細胞亞群也出現(xiàn)相應變化，CD3+呈不斷增多趨勢，CD4+亞群比例、CD4+/CD8+均在早期增多，而后隨著梗阻進展逐漸下降。反之，CD8+亞群比

12、例早期降低，后期增高，這些都預示著腸道免疫的一過性增強和之后的減弱；②通過對上皮內(nèi)IEL、固有層LPL占總細胞數(shù)量百分比的統(tǒng)計，可以看出，IEL變化存在一定改變，但本實驗尚未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學的差異。而LPL百分比特點也是梗阻早期增大，后期下降，這可能是淋巴細胞歸巢至固有層這一效應部位增多有關，后期隨著淋巴細胞凋亡增多和其它大量炎性細胞浸潤而至其比例下降；③s-IgA的量的變化進一步印證了上述現(xiàn)象，在早期腸腔內(nèi)增多，至后期逐漸低于正常水平；④腸

13、道免疫系統(tǒng)的激活是較早出現(xiàn)的，而且腸梗阻引發(fā)的腸免疫屏障改變可能存在部位上的差異，回腸更早、更強烈的出現(xiàn)免疫改變。而固有層效應部位上淋巴細胞可能這種差異并不明顯，有待印證。 第二部分：四君子湯對腸梗阻解除后腸功能障礙的調(diào)節(jié)作用的實驗研究 實驗六:四君子湯對腸梗阻解除后小腸上皮修復的調(diào)理作用 目的：利用可復性機械性完全性腸梗阻模型，觀察比較腸梗阻梗阻解除后自然恢復與中藥四君子湯對小腸上皮細胞增殖與修復的影響。

14、 方法：選用健康大耳白兔，隨機分為假手術組（Sham）、梗阻48模型組（M48）、自然恢復48h組（S48）、中藥治療48h組（T48）、自然恢復96h組（S96）、中藥治療96h組（T96），每組6只。對動物模型梗阻解除后48h、96h時腸杯狀細胞形態(tài)學、小腸組織鳥氨酸脫羧酶活性、血清瓜氨酸水平、緊密連接相關蛋白Claudin1 mRNA表達等分別進行檢測和觀察。 結(jié)論：①中藥四君子湯可以促進腸梗阻解除后腸上皮細胞的再增殖和

15、上皮完整性的修復過程，表現(xiàn)為其可以加速腸上皮內(nèi)杯狀細胞對腸上皮的重建的完成進度；②可以提高小腸組織ODC活性，提示四君子湯能提高上皮再生能力；③而上皮再生后的結(jié)果體現(xiàn)為血清瓜氨酸水平的提高；④四君子湯可以上調(diào)腸上皮緊密連接相關蛋白Claudin1的上游基因表達，促進腸上皮完整性的修復⑤通過結(jié)果說明腸梗阻解除后的腸功能障礙在辨證上存在脾胃虛的情況，邪實已祛，正氣受損的實質(zhì)可能應該包括腸上皮的損害，而四君子湯的作用靶點之一可能是促進腸隱窩干

16、細胞的增殖從而達到上皮完整性的修復。 實驗七: 四君子湯對腸梗阻解除后小腸免疫的調(diào)理作用 目的：利用可復性機械性完全性腸梗阻模型，觀察比較腸梗阻解除后自然恢復及中藥四君子湯對腸道免疫屏障的影響。 方法：選用健康大耳白兔，隨機分為假手術組（Sham）、梗阻48模型組（M48）、自然恢復48h組（S48）、中藥治療48h組（T48）、自然恢復96h組（S96）、中藥治療96h組（T96），每組6只。通過流式細胞術對動

17、物模型梗阻解除后48h、96h時PP淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）進行分析、利用ELISA法對腸道內(nèi)s-IgA含量進行檢測以及通過病理切片對IEL、LPL百分比進行計數(shù)。 結(jié)論：腸梗阻解除后小腸的免疫屏障功能紊亂并沒有立即恢復，自然恢復48h后CD4+、CD4+/CD8+比值等指標并沒有隨之恢復，而卻較M48組更趨下降，這可能提示腸功能的免疫狀態(tài)并沒有因腸梗阻解除而立即恢復，這可能是腸道內(nèi)環(huán)境紊