Collagenase A-A critical invasive factor in virulence of pathogenic Leptospira species.pdf

1、背景(background)：鉤端螺旋體(簡稱鉤體)分為致病性鉤體和非致病性鉤體兩大類。非致病性鉤端螺旋體存在于潮濕土壤和地表水中，屬于腐生性愿核細(xì)胞型微生物，不引起人或動物疾病。致病性鉤體中目前至少確定有7種基因種，如Leptospirainterrogans、Leptospiraborgpetersenii、Leptospirakirschneri和Leptospiraweilii等，其中問號鉤體(L.interrogans)是流行

2、最廣的致病性鉤體。由致病性鉤體感染引起的鉤體病是全球流行的人畜共患傳染病，好發(fā)于熱帶或亞熱帶國家或地區(qū)，我國也是鉤體病主要疫區(qū)之一。致病性鉤體有強(qiáng)大的侵襲力，能迅速通過皮膚或黏膜侵入血流，引起中毒性敗血癥癥狀，如高熱、頭痛、肌痛等，鉤體隨血流侵入肺、肝、腎等臟器，引起肺出血、黃疸和腎功能損傷，常因呼吸或腎功能衰竭而導(dǎo)致死亡，其中肺彌漫性出血鉤體病死亡率高達(dá)50％以上。鼠類和家畜是鉤體主要動物宿主，感染鉤體后雖無明顯癥狀，但可長期甚至終身

3、從尿液排出鉤體，污染土壤或水系成為疫源地。然而，鉤體不產(chǎn)生任何典型的外毒素，其脂多糖(LPS)毒性僅為大腸桿菌LPS的1/10～1/100,故鉤體毒力因子及其致病機(jī)制至今所知甚少。細(xì)菌膠原酶可以有效降解宿主結(jié)締組織及胞外基質(zhì)(extracellularmatrix)中的膠原蛋白，是不少病原菌重要的侵襲性毒力因子之一。在問號鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組中，含有一個膠原酶編碼基因(colA)。如前所述，致病性鉤體有強(qiáng)大的侵襲力，但至今未見致

4、病性鉤體膠原酶功能及其致病性的研究報道。
　　 目的(aim)：了解鉤體膠原酶水解不同膠原蛋白底物能力及特異性、最佳工作pH和金屬離子濃度等酶動力學(xué)特征，采用問號鉤體黃疸出血群賴型賴株膠原酶基因敲除突變株(colA￣)金地鼠感染模型，采用基因敲除技術(shù)了解鉤體膠原酶基因?qū)鸬厥蠖玖Α⒎魏透渭澳I組織中鉤體載量及組織病變的影響，闡明鉤體膠原酶工作機(jī)制及其致病意義。
　　 方法(methods)：以我國流行最廣的問號鉤體黃疸出血

5、群賴型賴株基因組DNA為模板，采用高保真PCR擴(kuò)增全長colA基因，T-A克隆后測序。以pET42a為表達(dá)載體、E.coliBL21DE3為表達(dá)宿主菌，構(gòu)建膠原酶原核表達(dá)系統(tǒng)E.coliBL21DE3PET42a-colA。采用0.5mMIPTG28℃2誘導(dǎo)E.coliBL21DE3PET42a-colA表達(dá)重組ColA蛋白(rColA)、Ni-NTA親和層析柱提純rColA，采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查rC

6、olA表達(dá)情況及提純效果。采用多種膠原酶蛋白底物(多種膠原蛋白、Azocoll和Pz-肽)、不同pH和金屬離子及濃度緩沖液，了解鉤體重組膠原酶最佳膠原蛋白底物、pH和金屬離子及其濃度等酶動力學(xué)特征。采用實時熒光定量RT-PCR及WesternBlot檢測感染問號鉤體黃疸出血群賴型賴株感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)或人腎上皮細(xì)胞(HEK293)后colA基因表達(dá)水平變化及分泌情況。采用基于自殺質(zhì)粒的基因敲除技術(shù)，構(gòu)建問號鉤體黃疸出血群

7、賴型賴株膠原酶基因敲除突變株(colA￣)。將不同濃度colA￣突變株或野生株腹腔注射攻擊鉤體敏感動物金地鼠，了解colA￣突變株或野生株對金地鼠毒力差異(LD50)。采集colA￣突變株與野生株感染金地鼠的肺、肝、腎組織標(biāo)本，固定、包埋、切片后分別HE和銀染色，觀察各組織標(biāo)本中鉤體載量及組織病變的差異。
　　 結(jié)果(results)：我們克隆的鉤體colA基因序列與GenBank中公布的問號鉤體黃疸出血群賴型賴株鉤體colA基

8、因序列有很高的相似性。所構(gòu)建的鉤體colA基因原核表達(dá)系統(tǒng)EcoliBL21DE3PET42a-colA能有效表達(dá)目的重組蛋白rColA，Ni-NTA親和層析柱純化的rColA經(jīng)SDS-PAGE后在凝膠中顯示為單一的蛋白條帶。rColA在37℃、pH7.4、0.4mMCaCl2-50mMTris-HCl緩沖液中有最佳水解底物的效果，盡管rColA能在不同程度上水解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白及Azocoll、Pz-肽廣泛的底物特異性，但最佳

9、水解底物為Ⅲ型膠原蛋白。WesternBlot檢測結(jié)果顯示，問號鉤體黃疸出血群賴型賴株EMJH培養(yǎng)物上清中未檢出ColA蛋白，但感染人臍靜脈細(xì)胞(HUVEC)和人腎上皮細(xì)胞(HEK293)后colA-mRNA水平迅速升高并在感染細(xì)胞后6h達(dá)到峰值，問號鉤體黃疸出血群賴型賴株與HUVEC或HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)物上清中可檢出ColA蛋白。問號鉤體賴株colA￣突變株及野生株對金地鼠的LD50分別約為108和106。colA￣突變株感染的金

10、地鼠肺、肝、腎組織中鉤體載量明顯低于野生株，肺、肝、腎組織病變也明顯輕于野生株。
　　 結(jié)論(conclusion)：問號鉤體黃疸出血群賴型賴株colA基因表達(dá)產(chǎn)物ColA是一種膠原酶，對不同膠原酶底物具有廣泛但不同程度的水解活性，但其最佳水解底物為Ⅲ型膠原蛋白。問號鉤體賴株在體外培養(yǎng)基中不分泌ColA蛋白，但感染宿主細(xì)胞后ColA蛋白表達(dá)水平顯著升高并可外分泌。colA基因敲除的問號鉤體賴株對金地鼠毒力明顯減弱，肺、肝和腎組織