競(jìng)爭(zhēng)性抑制缺氧誘發(fā)因子1α與VHL蛋白結(jié)合的多肽對(duì)血管形成的促進(jìn)作用.pdf

1、缺血性心臟病是世界上發(fā)病率及死亡率最高的疾病。當(dāng)藥物不足以達(dá)到治療目的時(shí)，通常需要進(jìn)行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架術(shù)或冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)來(lái)進(jìn)行血管重建。然而，仍然有一部分患者無(wú)法進(jìn)行介入性血管重建術(shù)，這些患者通?；加袕浡怨跔顒?dòng)脈病變、缺乏適當(dāng)?shù)难苓M(jìn)行搭橋術(shù)、遠(yuǎn)端冠狀動(dòng)脈狹小、合并其他嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病或一些血管重建術(shù)后發(fā)生再狹窄的患者。由于心肌梗塞面積與側(cè)支循環(huán)流量成負(fù)相關(guān)，治療性血管形成的療法通過(guò)改善缺血心肌的血供而改善患者的臨床癥狀成為很有希望

2、的新的治療缺血性心臟病的方法。 目前VEGF及FGF家族的生長(zhǎng)因子在治療性血管形成中的作用得到了廣泛的研究。結(jié)果表明它們能明顯促進(jìn)新生血管的形成，但新生的血管常伴有水腫、炎癥和自發(fā)性出血性潰瘍，將VEGF與其他促進(jìn)血管形成的因子聯(lián)合應(yīng)用能減少新生血管的缺陷。于是人們將目光轉(zhuǎn)向能調(diào)節(jié)多種促進(jìn)血管形成因子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，即缺氧誘發(fā)因子-1(HIF-1)。研究表明，HIF-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的新生血管在結(jié)構(gòu)與形態(tài)上與正常血管相似，功能正常。而

3、且，在缺氧情況下，HIF-1的表達(dá)增加，通過(guò)促進(jìn)一系列目的基因的表達(dá)調(diào)節(jié)缺氧組織氧的需求與供應(yīng)之間的平衡，促進(jìn)缺氧細(xì)胞的成活?？梢?jiàn)，提高HIF-1的表達(dá)及活性對(duì)于缺血性疾病的治療有著很大的應(yīng)用前景。 本課題用基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)確定了HIF-1α與VHL結(jié)合的最小有效的區(qū)域，使之在細(xì)胞及組織中過(guò)表達(dá)，探討過(guò)表達(dá)的結(jié)合區(qū)域是否能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制VHL蛋白與細(xì)胞內(nèi)源性HIF-1α的結(jié)合，從而穩(wěn)定HIF-1α蛋白，解除VHL蛋白對(duì)HI

4、F-1α活性的抑制作用，促進(jìn)HIF-1目的基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)血管形成，為缺血性疾病的治療提供新的方法。 方法： 1.質(zhì)粒重組體的制備 2.細(xì)胞培養(yǎng)與短暫性轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 3.缺氧反應(yīng)元件(HRE)驅(qū)動(dòng)的蟲(chóng)螢光素報(bào)告基因產(chǎn)物活性的分析：將不同的載有VHL結(jié)合區(qū)域的質(zhì)粒重組體分別與HRE驅(qū)動(dòng)的蟲(chóng)熒光素報(bào)告基因一起轉(zhuǎn)染至不同細(xì)胞中。44小時(shí)后分析蟲(chóng)熒光素活性。HRE驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因產(chǎn)物的活性代表內(nèi)源性HIF-1α的活性。

5、 4、免疫共沉淀反應(yīng)：用體外免疫共沉淀反應(yīng)分析VHL蛋白與HIF-1α不同片段及突變體的結(jié)合。用體內(nèi)免疫共沉淀反應(yīng)分析細(xì)胞提取物中內(nèi)源性HIF-1α蛋白水平的變化。沉淀的蛋白經(jīng)聚丙烯凝膠蛋白電泳分離后分別用放射性自顯影或WesternBolotting進(jìn)行檢測(cè)。 5.蛋白電泳及WesternBolotting：用聚丙烯凝膠蛋白電泳的方法分離免疫沉淀的蛋白或全細(xì)胞提取物中的蛋白，轉(zhuǎn)到硝化纖維素膜上，用抗FLAG-M2單克隆

6、抗體檢測(cè)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α不同片段的表達(dá)；用抗HIF-1α單克隆或多克隆抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性HIF-1α蛋白水平的變化。 6.共聚焦顯微鏡的觀察：在蓋玻片上培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，將載有GFP基因的質(zhì)粒短暫性轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)44小時(shí)后，用4％的多聚甲醛在室溫下固定細(xì)胞。在共聚焦顯微鏡下觀察表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，分別觀察約200個(gè)細(xì)胞，分為絕對(duì)核內(nèi)分布(N)、核內(nèi)分布大于胞漿分布(N＞C)及核內(nèi)分布等于胞漿分布(N=C)。

7、 7.鼠角膜血管形成的分析：根據(jù)Cao等1988年描繪的方法將化學(xué)合成的多肽包裹在硫酸蔗糖鋁微球表面，植入眼角膜下，五天后用裂隙燈觀察角膜內(nèi)新生血管的形成。 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間行t檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異。 結(jié)果：一、在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)的VHL結(jié)合區(qū)域?qū)?xì)胞內(nèi)源性HIF-1α蛋白及其活性的影響 1.體內(nèi)免疫共沉淀反應(yīng)及蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果表明在未轉(zhuǎn)染VHL結(jié)合區(qū)域的細(xì)胞中，內(nèi)源

8、性HIF-1α蛋白因?yàn)楹芸毂唤到舛茈y檢測(cè)到。當(dāng)VHL結(jié)合區(qū)域mHIF-1α(546-574)在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)后，可以檢測(cè)到穩(wěn)定的HIF-1α蛋白，約120kDa。 2.HRE驅(qū)動(dòng)的蟲(chóng)螢光素報(bào)告基因產(chǎn)物的活性分析顯示，作為對(duì)照組，在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)FLAG-GAL4對(duì)內(nèi)源性HIF-1α的活性無(wú)影響，VHL結(jié)合區(qū)域的過(guò)表達(dá)能提高內(nèi)源性HIF-1α的活性，成劑量依賴性，與對(duì)照組FLAG-GA14相比，有顯著性差異。 二、VHL結(jié)合

9、區(qū)域穩(wěn)定內(nèi)源性HIF-1α蛋白、提高內(nèi)源性HIF-1α活性的作用機(jī)制 1.體外免疫共沉淀反應(yīng)的結(jié)果表明野生型的VHL結(jié)合區(qū)域能很好地與VHL蛋白結(jié)合，而脯氨酸563突變的VHL結(jié)合區(qū)域則不能與VHL結(jié)合。 2.在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)源性HIF-1α蛋白穩(wěn)定，當(dāng)恢復(fù)正常氧濃度培養(yǎng)5分鐘后，在過(guò)表達(dá)脯氨酸563突變的VHL蛋白結(jié)合區(qū)域的細(xì)胞中，內(nèi)源性HIF-1α蛋白被迅速降解，而在過(guò)表達(dá)野生型VHL結(jié)合區(qū)域的細(xì)胞中，內(nèi)源性

10、HIF-1α蛋白的降解被抑制。 3.HRE驅(qū)動(dòng)的蟲(chóng)螢光素報(bào)告基因產(chǎn)物的活性分析顯示野生型的VHL結(jié)合區(qū)域提高了內(nèi)源性HIF-1α的活性，具有劑量依賴性，與相對(duì)應(yīng)濃度的GAL4相比，有顯著性差異。而過(guò)表達(dá)的脯氨酸突變的VHL結(jié)合區(qū)域則喪失了這一功能。 三、確定VHL結(jié)合區(qū)域中的關(guān)鍵氨基酸 在HepG2及鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞(MBEC)進(jìn)行的HRE驅(qū)動(dòng)的蟲(chóng)螢光素報(bào)告基因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型VHL結(jié)合區(qū)域相比，除了P563A

11、及PYI-DDD突變體已知不能結(jié)合VHL而喪失提高內(nèi)源性HIF-1α活性的功能外，突變體D570A、L573A及FL571/573AA的功能也明顯減弱或消失，說(shuō)明氨基酸D570及L573在與VHL的結(jié)合中起著至關(guān)重要的作用。 四、確定與VHL結(jié)合的最小而有效的區(qū)域 1.體外免疫共沉淀反應(yīng)結(jié)果顯示，全長(zhǎng)HIF-1α即mHIF-1α(1-822)及VHL結(jié)合區(qū)域HIF-1α(546-574)均與VHL蛋白結(jié)合，mHIF-1α

12、(546-574)與VHL蛋白的結(jié)合大于全長(zhǎng)HIF-1α。當(dāng)羧基端的QL兩個(gè)氨基酸殘基被刪除后則不能與VHL蛋白結(jié)合，所以羧基端保留至L573。從氨基端逐漸刪除后，VHL結(jié)合區(qū)域與VHL蛋白的結(jié)合能力逐漸下降，mHIF-1α(559-573)與VHL蛋白的結(jié)合仍很強(qiáng)，而mHIF-1α(560-573)及mHIF-1α(561-573)與VHL蛋白的結(jié)合能力明顯減弱。 2.HRE驅(qū)動(dòng)的蟲(chóng)螢光素報(bào)告基因活性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VHL結(jié)合區(qū)

13、域mHIF-1α(559-573)在內(nèi)皮細(xì)胞中的作用最強(qiáng)，而在HepG2細(xì)胞中仍有效，其作用明顯高于圍繞脯氨酸402的VHL結(jié)合區(qū)域中的18個(gè)氨基酸的區(qū)域，表明HIF-1α(559-573)這個(gè)包含15個(gè)氨基酸的區(qū)域是最小而有效的VHL結(jié)合區(qū)域。 五、過(guò)表達(dá)的VHL結(jié)合區(qū)域在細(xì)胞內(nèi)的分布對(duì)其活性的影響 1.對(duì)內(nèi)源性HIF-1α蛋白水平的分析結(jié)果表明在沒(méi)有經(jīng)過(guò)MG132處理的細(xì)胞中，正常氧情況下，內(nèi)源性HIF-1α不能被檢

14、測(cè)到，缺氧的環(huán)境使HIF-1α蛋白穩(wěn)定，再給氧后內(nèi)源性HIF-1α蛋白被迅速降解，在細(xì)胞核內(nèi)6分鐘后即達(dá)到半衰期，在細(xì)胞漿內(nèi)降解更快，約4分鐘后達(dá)半衰期。經(jīng)MG132處理后，HIF-1α在細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi)的降解過(guò)程受到抑制。這一結(jié)果表明，內(nèi)源性HIF-1α的降解是由蛋白酶體介導(dǎo)的，這一過(guò)程即發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)也發(fā)生在細(xì)胞漿內(nèi)。 2.HRE驅(qū)動(dòng)的蟲(chóng)螢光素報(bào)告基因活性分析及共焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，F(xiàn)LAG-GFP-HIF-1α(559-

15、573)在細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi)均有大量分布，其過(guò)表達(dá)后促進(jìn)內(nèi)源性HIF-1α的活性，呈劑量依賴性；而FLAG-GFP-NLS-HIF-1α(559-573)主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，只有少量分布在細(xì)胞漿內(nèi)，其促進(jìn)內(nèi)源性HIF-1α活性的作用明顯下降；當(dāng)FLAG-GFP-NLS-HIF-1α(559-573)中的NLS被突變而喪失其核導(dǎo)入信號(hào)的作用后，這一VHL結(jié)合區(qū)域又呈全細(xì)胞分布，而且恢復(fù)了其對(duì)內(nèi)源性HIF-1α活性的促進(jìn)作用。 六、化