殼聚糖修飾氧化鐵磁性納米顆粒及應用于細胞選擇攝取研究.pdf

1、氧化鐵磁性納米顆粒在磁共振成像對比度增強、組織修復、免疫測定、高熱療法、藥物釋放和細胞分選等方面有著廣闊的應用前景。根據(jù)不同的應用需求，合理構(gòu)建磁性納米材料的物理化學性質(zhì)，深入研究其生物學效應，尤其在細胞層面有更深入的認識和操控能力是當前研究的熱點之一。磁性納米顆粒在活細胞成像技術(shù)己顯示出巨大的潛力，合理的表面改性、納米化學和連接相關(guān)的生物分子能夠有效克服當前細胞成像的一些局限性，例如迅速有效的攝取納米粒子、有效放大成像信號和提高成像質(zhì)

2、量等。影響細胞成像技術(shù)的主要因素包括納米粒子濃度、電荷、尺寸、表面性質(zhì)和聚集態(tài)等，更好地了解納米粒子對細胞的影響、細胞攝取的機制將對納米粒子細胞成像技術(shù)的發(fā)展將產(chǎn)生深遠的影響。
　　 本文選用天然高分子多糖殼聚糖作為修飾材料，它是一種在自然界廣泛存在、具有氨基和羥基基團的天然高分子多糖，具有無毒，無抗原性，生物相容性好、生物可降解性、促進細胞吸收等優(yōu)點。用它修飾氧化鐵磁性納米顆粒(γ-Fe2O3，MNPs)表面，得到適合生物醫(yī)學

3、應用的樣品；合成能夠高效標記癌細胞的熒光衍生殼聚糖磁性納米探針；研究不同表面性質(zhì)、聚集態(tài)的磁性納米顆粒對癌細胞的作用；探討殼聚糖磁性納米顆粒攝入癌細胞的動力學過程;構(gòu)建在生理環(huán)境下相對穩(wěn)定、高免疫活性、體內(nèi)外特異性靶向卵巢癌細胞的分子影像探針抗精子蛋白17-磁性納米顆粒。本研究主要工作包括以下幾方面：
　　 ⑴通過共沉淀法制備氧化鐵磁性納米顆粒，用殼聚糖對其表面進行修飾得到樣品(CS@MNPs)；表征其形貌結(jié)構(gòu)、尺寸、表面基團、

4、表面電荷、磁學性質(zhì)和在不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性等。實驗結(jié)果表明，CS@MNPs具有典型的立方反尖晶石晶體結(jié)構(gòu)；粒徑為16.5nm；在生理條件下(pH值7.4)擁有較高的正電荷(10mV)；呈現(xiàn)超順磁性，對馳豫時間T1、T2，尤其是T2*具有很強的響應；在雙蒸餾水和含10％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中具有良好的穩(wěn)定性，滿足下一步生物醫(yī)學應用的要求。
　　 ⑵構(gòu)建同時具有熒光和磁性的納米結(jié)構(gòu)有利于在體的疾病診斷，實現(xiàn)實時在線示蹤活

5、細胞。通過FITC的異硫氰酸根與殼聚糖的氨基結(jié)合得到具有熒光性質(zhì)的改性殼聚糖(FITC-CS)，修飾磁性納米顆粒，得到一種簡單、穩(wěn)定的雙功能納米探針，它同時具有熒光和磁學性質(zhì)。與人肝癌細胞SMMC-7721共孵育，通過流式細胞術(shù)、磁共振成像、熒光顯微鏡等手段證明這種FITC-CS磁性納米探針能夠高效的標記癌細胞。在細胞數(shù)量為1×104時，T2*信號強度明顯降低。細胞活性試驗證明這種探針有良好的生物相容性，符合生物醫(yī)學應用的要求。

6、　　 ⑶研究了不同表面以及不同聚集狀態(tài)的磁性納米顆粒對人肝癌細胞SMMC-7721和人鼻咽癌細胞KB攝入量的影響。制備了三種樣品：二巰基丁二酸修飾的磁性納米顆粒(DMSA@MNPs，17.3nm，帶負電)，殼聚糖修飾的磁性納米顆粒(CS@MNPs，16.5nm，帶正電)，以及殼聚糖與DMSA@MNPs通過靜電吸附作用形成磁性聚集體(CS-DMSA@MNps，85.7nm，帶正電)。研究了三種材料與SMMC-7721和KB細胞共孵育后的

7、攝入情況；考察了不同的作用包括細胞形態(tài)、細胞的存活、以及細胞攝入鐵的量、磁共振成像T2*信號強弱等。結(jié)果表明，影響癌細胞攝取的因素包括材料的表面性質(zhì)、聚集狀態(tài)、孵育時間、初始濃度等。三種納米材料都可以進入細胞，CS-DMSA@MNPs攝入量大于CS@MNPs，DMSA@MNPs最少。說明表面帶正電荷的磁性納米顆粒比帶負電荷的更容易進入細胞；癌細胞攝取聚集體狀態(tài)MNPs的能力更強，而且一定程度的聚集能夠縮短橫向馳豫時間，有利于增強對比度；

8、殼聚糖修飾磁性材料后可以明顯提高癌細胞的攝入量，說明殼聚糖具有較強的吸收促進作用，能夠有效增加細胞攝取。
　　 ⑷采用磁共振T2*信號強度作為細胞攝取磁性納米顆粒的指標，初步探討了在不同孵育溫度(4℃，37℃)下磁性納米顆粒CS@MNPs攝入人肝癌細胞SMMC-7721的動力學過程。實驗證明癌細胞對納米顆粒的內(nèi)吞是一個依賴于培育溫度、顆粒的濃度和共孵育時間的耗能過程，并在胞內(nèi)的積累量逐漸達到飽和，有利于磁共振成像信號的放大。磁性

9、納米顆粒攝入癌細胞攝取可以分為兩個過程，先是吸附在細胞膜表面，隨后再通過內(nèi)吞或者胞飲的方式進入細胞器。通過抑制劑預處理細胞的實驗結(jié)果可知，Clathrin蛋白抑制劑對細胞的內(nèi)吞能力有較強的抑制;線粒體呼吸鏈抑制劑對細胞的攝取有一定影響;微管蛋白抑制劑和細胞膜穴樣凹陷抑制劑對細胞的抑制作用較弱。人肝癌細胞SMMC-7721對CS@MNPs的攝取主要是在網(wǎng)格蛋白的介導下，通過液相內(nèi)吞和吸附內(nèi)吞的共同作用完成的。
　　 ⑸利用精子蛋白

10、17構(gòu)建了一種新型的免疫磁性納米探針Anti-Sp17-MNPs，可作為特異性靶向卵巢癌的磁共振分子影像探針。在偶聯(lián)劑作用下，將殼聚糖修飾磁性氧化鐵納米顆粒與抗人Sp17抗體結(jié)合，得到免疫磁性納米探針(Anti-Sp17-MNPs)。通過透射電鏡、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白質(zhì)分析、鐵含量測定、酶聯(lián)免疫吸附試驗等手段，評價了免疫磁性納米探針的制備效果。結(jié)果表明此探針具有在生理環(huán)境下相對穩(wěn)定、高免疫活性等優(yōu)點。體外磁共振成像研究表明An