IL-23R遺傳變異、Th17淋巴細(xì)胞與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)性研究.pdf

1、強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是一種致病機(jī)理不明的慢性炎癥性疾病,在人群中的發(fā)病率約千分之三,僅次于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。該病具有明顯的家族聚集現(xiàn)象,并與HLA-B27密切相關(guān)。其主要侵犯中軸骨骼,以骶髂關(guān)節(jié)炎和附著點(diǎn)炎為特征,炎癥累及滑膜關(guān)節(jié)和軟骨關(guān)節(jié)以及肌腱、韌帶附著于骨的部位(肌腱端),常引起纖維性和骨性強(qiáng)直。其他器官亦常累及,如25％～30％的患者可在病程中出現(xiàn)急性前色素膜炎。AS的致殘率極高,給患者

2、、家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 眾所周知,HLA-B27是AS最主要的易感基因,但孿生子及家族調(diào)查研究顯示,這種疾病是寡基因型的,且HLA-B27只能解釋該病的遺傳度中小于50％的部分。有研究報(bào)道IL-23R基因的多態(tài)性與AS高度相關(guān),在該病的人群歸因危險(xiǎn)度中發(fā)揮了近12％的作用。 盡管目前該病的致病機(jī)制不明,但普遍認(rèn)為AS患者體內(nèi)免疫功能失衡與其病理、臨床表現(xiàn)密切相關(guān),其中T細(xì)胞免疫功能異常在其發(fā)病中起著尤為

3、重要的作用。越來(lái)越多的證據(jù)顯示,細(xì)胞因子的分泌特點(diǎn)也可以影響脊柱關(guān)節(jié)病的臨床進(jìn)程。Th17細(xì)胞是近年新發(fā)現(xiàn)的一種輔助性T細(xì)胞,其各種特性與Th1和Th2細(xì)胞不同,產(chǎn)生的細(xì)胞因子包括IL-17、IL-21和IL-22等等。已有研究證實(shí),Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)、炎性腸病(Inflammatory bowel dise

4、ase,IBD)等的致病機(jī)制中都發(fā)揮了重要作用,其分化和功能受各種細(xì)胞因子的調(diào)控。而IL-23R對(duì)一個(gè)Th17細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一個(gè)關(guān)鍵的作用因子。 本研究擬在中國(guó)漢族人群中鑒定與AS相關(guān)的IL-23R基因的變異體區(qū)域,同時(shí)研究IL-23R基因的遺傳變異體是否能影響Th17細(xì)胞數(shù)量和功能,進(jìn)而導(dǎo)致AS發(fā)病。具體分為以下三個(gè)部分： 第一部分 IL-23R單核苷酸多態(tài)性在強(qiáng)直性脊柱炎疾病中國(guó)漢族人群的研究 目的：在中國(guó)人群中

5、對(duì)IL-23R的8個(gè)SNP位點(diǎn)(rs11209026、rs1004819、rs10489629、rs11465804、rs1343151、rs10889677、rs11209032、rs1495965)進(jìn)行檢測(cè),研究IL-23R單核苷酸多態(tài)性與AS易感性的關(guān)系。 方法：參考1984年修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn),從門診及住院病人中收集AS患者109例,正常對(duì)照者150例。運(yùn)用TagMan MGB探針?lè)▽?duì)AS患者及正常對(duì)照IL-23R的8個(gè)SN

6、P位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。多態(tài)性及其單倍型與AS相對(duì)危險(xiǎn)度等數(shù)據(jù)處理均采用SPSS軟件系統(tǒng)進(jìn)行。 結(jié)果:IL-23R SNPs相關(guān)的8個(gè)位點(diǎn)(rs11209026、rs1004819、rs10489629、rs11465804、rs1343151、rs10889677、rs11209032、rs1495965)在中國(guó)漢族人群中與AS具有顯著相關(guān)性(P＜0.001)。其中,相關(guān)性最強(qiáng)的SNP為rs11209032(優(yōu)勢(shì)比1.3,95％CI

7、1.2-1.4,P=3.5×10-8)。本部分針對(duì)這一基因結(jié)合臨床AS病例分析,發(fā)現(xiàn)rs11209032A/G基因型、rs11209032A/A基因型和rs11209032G/G基因型在強(qiáng)直性脊柱炎患者中有62例(56.1％)、32例(29.4％)和15例(13.8％),正常對(duì)照組分別有71例(47.3％)、45例(30％)和34例(22.7％),兩組間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 第二部分 Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)及

8、功能的初步探討 第一節(jié) Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè) 目的：通過(guò)檢測(cè)外周血中IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6以及TGFβ-1的水平,明確AS患者與正常人之間、不同病情分級(jí)AS患者之間Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的差異,以期探尋Th17細(xì)胞在AS致病機(jī)理中發(fā)揮的作用。 方法：參考1984年修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn),從門診及住院病人中收集AS患者87例,正常對(duì)照者91例。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)以及實(shí)時(shí)熒光定

9、量PCR(Real-timePCR)的方法分別從蛋白水平和mRNA水平在AS患者和正常人中對(duì)IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6以及TGFβ-1進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)將AS患者根據(jù)BASDAI≤4靜止期和BASDAI＞4活動(dòng)期分為兩組,進(jìn)行AS患者組間各細(xì)胞因子水平的比較。運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)以及SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：①AS患者IL-17蛋白水平和mRNA水平檢測(cè)均明顯高于正常對(duì)照組(75.45±6

10、.46 vs 41.97±2.27,P＜0.001:0.003240±0.000872 vs 0.007643±0.001656,P＜0.05);將AS患者根據(jù)BASDAI≤4靜止期和BASDAI＞4活動(dòng)期分為兩組,進(jìn)行AS患者組間IL-17mRNA水平比較,活動(dòng)期AS患者IL-17mRNA水平高于靜止期AS患者(0.001213±0.000765 vs 0.0045614±0.001404,P＜0.05)。②AS患者IL-23蛋白水平

11、和mRNA水平檢測(cè)均明顯高于正常對(duì)照組(61.85±2.61 vs 54.45±2.54,P＜0.05;0.038562±0.013772 vs 0.078789±0.014030,P＜0.05);AS患者分級(jí)比較IL-23 mRNA水平,活動(dòng)期AS患者IL-23mRNA水平高于靜止期AS患者(0.010229±0.001813 vs0.067947±0.027626,P＜0.05)。③AS患者IL-1β蛋白水平和mRNA水平檢測(cè)均明顯

12、高于正常對(duì)照組(28.45±0.87 vs 22.25±0.60,P＜0.001;0.324742±0.128426 vs1.426351±0.464371,P＜0.05);AS患者分級(jí)比較IL-1βmRNA水平,活動(dòng)期AS患者水平與靜止期AS患者無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。④AS患者IL-6蛋白水平和mRNA水平檢測(cè)均明顯高于正常對(duì)照組(5.10±0.52 vs 2.79±0.31,P＜0.001;0.013524±0.005065

13、vs 0.058685±0.015024,P＜0.05);AS患者分級(jí)比較IL-6 mRNA水平,活動(dòng)期AS患者IL-6mRNA水平高于靜止期AS患者(0.003831±0.001475 vs 0.044567±0.013595,P<0.05)。⑤AS患者TGFβ-1蛋白水平和mRNA水平檢測(cè)均明顯高于正常對(duì)照組(14.09±1.76 vs 3.59±0.60,P<0.001:0.200738±0.048957 vs 1.098782±

14、0.318909,P<0.05):AS患者分級(jí)比較TGFβ-1 mRNA水平,活動(dòng)期AS患者TGFβ-1 mRNA水平高于靜止期AS患者(0.058109±0.017780 vs 0.256579±0.075089,P<0.05)。 結(jié)論：這些結(jié)果提示AS患者外周血中IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6以及TGFβ-1細(xì)胞因子水平均顯著高于正常對(duì)照,且活動(dòng)期AS患者外周血中IL-17、IL-23、IL-6以及TGFβ-1

15、細(xì)胞因子水平均顯著高于靜止期AS患者,說(shuō)明Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子可能在AS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。 第二節(jié) Th17細(xì)胞功能的初步探討 目的：檢測(cè)AS患者和正常對(duì)照外周Th17細(xì)胞分布狀態(tài),并比較其差異；同時(shí),觀察不同細(xì)胞因子刺激對(duì)Th17分化的影響,探討AS患者及正常人Th17細(xì)胞功能的異同。 方法：收集AS患者10例,正常對(duì)照15例。Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),用佛波酯和鈣離子載

16、體刺激5小時(shí)后,抗CD4-FITC和抗IL-17PE、抗CD8-FITC和抗IL-17-PE標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+IL-17+T、CD8+IL-17+T細(xì)胞的比例。將一部分PBMC加入不同的細(xì)胞因子組合IL-1β+IL-6、IL-1β+IL23、IL-6+IL23、IL-1β+IL23+IL-6進(jìn)行培養(yǎng)5天,抗CD4-FITC和抗IL-17-PE標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-17的相對(duì)含量。 結(jié)果：①AS患者外周血中CD4+I

17、L-17+淋巴細(xì)胞高于正常人群(2.79±0.20 vs0.06±0.01 P<0.01),而且IL-17主要是由CD4+T淋巴細(xì)胞分泌,CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)較少。②不同細(xì)胞因子對(duì)T細(xì)胞刺激培養(yǎng)后,結(jié)果顯示IL-1β和IL-6細(xì)胞因子組合對(duì)細(xì)胞表達(dá)IL-17刺激作用較為明顯。 結(jié)論:AS患者外周血IL-17+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞外周血分布高于正常對(duì)照組,且以CD4+IL-17+細(xì)胞群為主。IL-1β和IL-6可有效的刺激人Th17細(xì)胞