重組生長激素（rhGH）對放射性小腸黏膜損傷的修復(fù)作用.pdf

1、研究背景 自從放射治療技術(shù)應(yīng)用于臨床，放療導(dǎo)致的急性胃腸道并發(fā)癥一直引起醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。在八十年代的國內(nèi)外報道中，放射性腸炎的發(fā)生率一直很高。近年來雖然醫(yī)療技術(shù)有很大進(jìn)步，但放射性腸炎的發(fā)生仍然十分常見。 放射性損傷是由于放射線使原來穩(wěn)定的細(xì)胞更新系統(tǒng)中增殖活躍的細(xì)胞減少而造成的。有絲分裂活躍的細(xì)胞對放射也最為敏感，治療劑量放射后數(shù)小時就可以觀察到腸黏膜發(fā)生異常的變化。腸黏膜細(xì)胞數(shù)量減少，絨毛變短，吸收面積縮小，隨后白細(xì)胞

2、浸潤，隱窩膿腫形成，上皮細(xì)胞死亡脫落，形成局灶性潰瘍。同時腸道出現(xiàn)對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收不良和代謝障礙。 放射性損傷通過影響腸上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)骨架蛋白的變化，引起細(xì)胞形態(tài)改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和腸黏膜屏障功能受損。所以，通過檢測腸上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中骨架蛋白的表達(dá)，可以間接了解腸黏膜屏障功能是否正常。在已有的文獻(xiàn)報道中，腸上皮細(xì)胞中骨架蛋白的表達(dá)通常被設(shè)為觀察指標(biāo)，但間質(zhì)細(xì)胞中的骨架蛋白變化少有提及。 在腸黏膜發(fā)生損傷時

3、，腸上皮細(xì)胞發(fā)生增殖和自我修復(fù)，有關(guān)細(xì)胞增殖情況的檢測目前大量研究都采用了細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)這一指標(biāo)。據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，小腸干細(xì)胞是腸黏膜受損傷后上皮細(xì)胞修復(fù)的主要細(xì)胞來源，但一直以來由于缺乏特異的標(biāo)記物而無法對小腸干細(xì)胞的增殖分化情況進(jìn)行觀察。最近研究證實，腸道上皮Musashi-1蛋白表達(dá)的部位與干細(xì)胞的部位具有非常良好的一致性，提示Musashi-1可作為小腸干細(xì)胞鑒定的重要標(biāo)志之一。 生長激素(grow horm

4、one，GH)可以通過影響腸黏膜隱窩細(xì)胞分裂周期及增加細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)腸絨毛生長和修復(fù)。有關(guān)其作用機制目前國內(nèi)外研究證實，生長激素可以通過刺激細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞的增生、提高腸黏膜細(xì)胞谷氨酰胺酶的活性，增加機體對谷氨酰胺的攝取和利用，還能夠上調(diào)應(yīng)激狀態(tài)下腸黏膜細(xì)胞蛋白質(zhì)mRNA的轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)對腸黏膜損傷的修復(fù)。鑒于目前小小鼠小腸黏膜損傷模型報道較少，黏膜損傷后的修復(fù)機制不明。本研究采用不

5、同放射劑量的射線對小鼠進(jìn)行放射性損傷，通過HE染色、細(xì)胞凋亡檢測和免疫組化方法檢測放射后小鼠小腸黏膜的一些損傷和修復(fù)指標(biāo)的變化，觀察建立小鼠放射損傷模型的可行性；在此基礎(chǔ)上，觀察重組重組人生長激素(rhGH)對放射損傷后小腸黏膜的修復(fù)作用及其可能機制。 研究目的 1.觀察小腸黏膜形態(tài)學(xué)改變，以及α-SMA、PCK、PCNA、Musashi-1在小腸黏膜表達(dá)的變化，了解小鼠小腸黏膜放射性損傷時的特點； 2.觀察rh

6、GH治療后各項指標(biāo)的變化，為進(jìn)一步研究小腸損傷的組織修復(fù)提供實驗依據(jù)。 研究對象與方法 1、實驗動物分組 實驗用雄性昆明小鼠，8周齡，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。60只雄性小鼠，體重20～25g，隨機分為6組，每組10只。空白組，不接受放射。模型組(包括ABC三組)，分別給予8Gy、12Gy、16Gy的劑量放射。空白組和模型組均于接受放射后12h處死，取小腸標(biāo)本，固定后石蠟包埋切片，檢測各項指標(biāo)。治療組，于接

7、受12Gy劑量放射12h后開始給予重組人生長激素(rhGH，瑞士雪蘭諾大藥廠)治療，rhGH的每次用量為0.8IU/Kg，腹腔內(nèi)注射，從12h開始到36h之間每間隔12h注射一次；對照組，也接受12Gy劑量放射并在治療組注射rhGH同時向腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水，90小時后將治療組和對照組處死，取小腸標(biāo)本，固定后常規(guī)石蠟包埋切片，觀察生長激素對小腸黏膜修復(fù)的作用。 2、放射性腸炎模型的建立 實驗小鼠經(jīng)用0.5﹪成巴比妥鈉腹

8、腔內(nèi)注射麻醉后，仰臥位固定四肢，用X射線進(jìn)行一次性腹部照射。照射部位為小鼠劍突下0.2cm至髂脊上緣連線中點，厚度為1cm；劑量率為2Gy/min，總劑量分別為8Gy、12Gy、16Gy，照射源至動物中心距離為1m。 3、實驗研究方法 (1) HE染色進(jìn)行小腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察。 (2) 小腸上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)測定，采用TUNEL染色法。 (3) 用免疫組化方法，檢測α-SMA、PCK、PCNA、Musash

9、i-1在小腸黏膜的表達(dá)水平。根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比進(jìn)行評分。 4、統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)處理均采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；多組問資料的比較采用方差分析，顯著性水準(zhǔn)為0.05。 結(jié)果 1.實驗動物進(jìn)食情況及處死后小腸的肉眼觀察及rhGH治療的影響在接受放射后，實驗動物出現(xiàn)精神萎靡，活動減少，以接受16Gy照射小鼠最為明顯，12Gy組和16Gy組部分小鼠出現(xiàn)腹部照射區(qū)域脫毛

10、情況，而16Gy組小鼠在照射后12h內(nèi)其中2只自然死亡。12h后處死取腸，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腸腔內(nèi)無明顯食物殘留。肉眼觀察8Gy組小腸外觀與空白組無明顯差別，12Gy組及16Gy組小腸出現(xiàn)充血，以后者為嚴(yán)重。 治療組和對照組小鼠處死前均能正常活動飲食，腸腔內(nèi)明顯食物殘留，小腸充血不明顯。 2.小腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察及rhGH治療的影響空白組小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)正常，絨毛排列整齊。模型組小腸黏膜明顯水腫，腸絨毛增粗，縮短或長短不一，上

11、皮細(xì)胞壞死脫落，部分絨毛缺損。腸腔內(nèi)見大量脫落、壞死的上皮細(xì)胞。 治療組和對照組上述病理改變明顯減輕，腸黏膜上皮基本完整。 3.在各組中的細(xì)胞凋亡情況及rhGH治療的影響模型組中的細(xì)胞凋亡指數(shù)隨放射劑量增大而增加，模型組和空白組各組問統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(P<0.05)。 治療組的細(xì)胞凋亡指數(shù)較對照組明顯減低，有顯著性差異(P<0.05)。 4．α-SMA在各組中的表達(dá)情況及rhGH治療的影響α-SMA

12、在模型組中的表達(dá)水平隨放射劑量增大而降低，模型組和空白組各組間統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(P<0.05)。 治療組的表達(dá)高于對照組，有顯著性差異(P<0.05)。 5.PCK在各組中的表達(dá)情況及rhGH治療的影響PCK在模型組中的表達(dá)隨著放射劑量增大而降低，模型組和空白組各組間統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(P<0.05)。 治療組的表達(dá)高于對照組，有顯著性差異(P<0.05)。 6.PCNA在各組中的表達(dá)情況及rh

13、GH治療的影響PCNA在模型組中的表達(dá)隨放射劑量增大而升高，各相鄰組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但相間隔兩組間差異顯著(P<0.05)。 治療組的表達(dá)高于對照組，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(P<0.05)。 7.Musashi-1在各組中的表達(dá)情況及。rhGH治療的影響Musashi-1在空白組呈低表達(dá)，16Gy模型組的表達(dá)較空白組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 治療組的表達(dá)高于對照組，統(tǒng)計學(xué)分析有顯

14、著性差異(P<0.05)。 小結(jié) 1.在模型組中，隨著放射劑量增大，小腸黏膜絨毛長度縮短，隱窩深度變淺。使用rhGH后，小腸黏膜損傷程度減輕。 2.小腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)隨放射劑量增大而增加；使用rhGH后，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降。 3.模型組中α-SMA、PCK隨放射劑量增大表達(dá)減低；使用rhGH后，表達(dá)較對照組增加。 4.在模型組中，PCNA和Musashi-1隨放射劑量增大表達(dá)增加；使用rhGH